[發(fā)明專利]一種用于檢測金葡菌腸毒素sea、seb、sec基因的三重?zé)晒舛縋CR試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010193860.7
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111378727A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫冰清;姜芹;張文剛;顧欣;黃士新;商軍;吳劍平;張浩然;黃家鶯;張妤
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市動物疫病預(yù)防控制中心(上海市獸藥飼料檢測所;上海市畜牧技術(shù)推廣中心)
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海驍象知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31315
• 代理人: 林煒

本發(fā)明提供了一種用于檢測腸毒素基因sea、seb、sec的熒光定量PCR試劑盒，包括含有Premix ExTaq、引物和探針、陽性質(zhì)粒及滅菌水，其中，引物、探針序列如SEQ ID No.1?9所示；所述的探針的5’端標(biāo)記有報告熒光基團，所述的探針的3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團。本發(fā)明還提供了采用上述的試劑盒檢測腸毒素基因sea、seb、sec的方法。通過本發(fā)明的試劑盒，可以迅速的檢測金葡菌腸毒素基因sea、seb及sec，對腸毒素進(jìn)行分型，為食物中毒的確診提供依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種試劑盒，具體來說是一種用于檢測金葡菌腸毒素sea、seb、sec基因的三重?zé)晒舛縋CR試劑盒。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌腸毒素是一類結(jié)構(gòu)、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)，是引起食物中毒的主要因子。據(jù)報道，1μg/kg的金葡菌腸毒素便可引起嘔吐、腹瀉等癥狀。在《葡萄球菌食物中毒的診斷標(biāo)準(zhǔn)、判定原則和處理原則(WS/T80-1996)》中規(guī)定“從中毒食物、患者吐瀉物中經(jīng)培養(yǎng)檢出金黃色葡萄球菌，菌株經(jīng)腸毒素檢測證實在不同樣品中檢出同一型別的腸毒素”，才能判定為腸毒素引起的食物中毒，因此金葡菌腸毒素的分型工作非常重要。對于金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，酶聯(lián)免疫法是應(yīng)用較多的檢測方法，但是免疫學(xué)的方法存在很多缺點。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，漸漸開始使用PCR方法對腸毒素基因進(jìn)行檢測。PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。目前國內(nèi)外對于腸毒素基因的檢測大多采用普通PCR或熒光定量PCR法逐一檢測，缺乏快速高效的多重qPCR方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測金葡菌腸毒素sea、seb、sec基因的三重?zé)晒舛縋CR試劑盒，所述的這種用于檢測金葡菌腸毒素sea、seb、sec基因的三重?zé)晒舛縋CR試劑盒要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測腸毒素基因的試劑盒時間長、程序繁瑣、成本太高，不利于大量樣本檢測的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種用于檢測腸毒素基因sea、seb、sec的熒光定量PCR試劑盒，包括

引物和探針，所述的引物、探針序列如下所示：

第一上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，

第一下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，

第一探針的序列如SEQ ID No.3所示，

第二上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，

第二下游引物的序列如SEQ ID No.5所示，

第二探針的序列如SEQ ID No.6所示，

第三上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，

第三下游引物的序列如SEQ ID No.8所示，

第三探針的序列如SEQ ID No.9所示，

任意一個所述的探針的5’端標(biāo)記有報告熒光基團，所述的探針的3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團。

進(jìn)一步的，所述試劑盒還包括Premix ExTaq、陽性質(zhì)粒及滅菌水。

本發(fā)明還提供了上述的試劑盒檢測腸毒素基因sea、seb、sec的的方法，包括如下步驟：

1)先配制qPCR反應(yīng)液，在每一個qPCR反應(yīng)體系中，所述的qPCR反應(yīng)液的體積為22μL，所述的qPCR反應(yīng)液包括12.5μL 2×濃度的Premix ExTaq、1μL的第一上游引物、1μL第一下游引物、0.5μL第一探針、1μL第二上游引物、1μL第二下游引物、0.5μL第二探針、1μL第三上游引物、1μL第三下游引物、0.5μL第三探針、2μL滅菌雙蒸水，任意一個引物和探針的濃度均為10μM；