[發明專利]一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法

有效

• 申請號: 202010192921.8
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111269879B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 魏強;馬保華;張俊鴻;張輝;劉潔;盧四海;馬馳原;姚舸;苗雨陽
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

本發明公開了一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法，本發明是能夠在奶山羊卵母細胞體外成熟培養過程中，通過添加合適的和合適濃度的減數分裂抑制物，先抑制卵母細胞恢復減數分裂，延長卵母細胞處于生發泡期的時間，使卵母細胞有充分的時間完成胞質成熟，然后恢復減數分裂完成核成熟，從而達到了核成熟和胞質成熟的同步化，有利于IVM卵母細胞后續發育率的提高，通過選擇最合適的CNP和雌激素濃度配比，以及減數分裂的抑制時間，使卵母細胞有充分的時間完成胞質成熟，然后恢復減數分裂完成核成熟，從而達到了核成熟和胞質成熟的同步化，進而提高IVM奶山羊卵母細胞后續發育率。

技術領域

本發明屬于材料領域，涉及一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法。

背景技術

隨著山羊體外受精、體細胞克隆和轉基因等技術的發展，對山羊卵母細胞的需求日益增加。獲得山羊卵母細胞的途徑主要有兩條，即體內沖取成熟卵母細胞和通過體外培養獲得成熟卵母細胞。卵母細胞體外成熟是指從卵巢中分離未成熟卵母細胞，在體外經過適宜的條件進行培養，使卵母細胞發育成熟并具有受精能力。IVM技術不僅減少了激素使用量降低了成本，而且可提供數量較多的卵母細胞，是目前常用的獲得山羊卵母細胞方法。卵母細胞的成熟包括核成熟和胞質成熟兩個基本環節。卵母細胞只有細胞核和胞質二者都成熟后，才能支持正常的胚胎發育。在體內，卵泡液中的抑制因子控制卵母細胞不過早自發恢復減數分裂，而使卵母細胞經歷一個相當長過程逐步獲得胞質成熟。而在體外，由于脫離了卵泡液的抑制環境，卵母細胞提前自發恢復減數分裂，胞質沒有充分的時間成熟，影響了后續發育能力，因此IVM獲得的卵母細胞雖然數量多，但卵母細胞的后續發育率遠不如體內成熟卵母細胞。為了改善IVM卵母細胞胞質成熟質量，一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法出現迫在眉睫。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法，通過比較在山羊卵母細胞IVM體系中單獨添加CNP或共同添加CNP和雌激素，通過對卵母細胞核成熟、胞質成熟和卵母細胞后續發育能力的分析，篩選CNP抑制山羊卵母細胞減數分裂以達到核質同步成熟并提高IVM卵母細胞質量的合適應用條件，不僅為利用CNP提高IVM山羊卵母細胞質量提供理論和實驗基礎，而且將以此為依托，建立一套新的高效的奶山羊卵母細胞體外成熟培養技術體系，為奶山羊胚胎工程的產業化提供更多的高質量的卵母細胞。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法，其特征在于，包括卵巢收集和卵丘-卵母細胞復合體采集、卵母細胞體外成熟培養以及卵母細胞孤雌激活和胚胎的培養；

所述卵巢收集和卵丘-卵母細胞復合體采集過程具體如下：

1)自當地屠宰場采集卵巢；

2)將采集的卵巢放置在22℃～25℃的無菌生理鹽水中，并在3h內運回實驗室；

3)在含有0.1％PVA的mDPBS中收集卵丘-卵母細胞復合體；

4)將卵丘-卵母細胞復合體放置在實體顯微鏡下，通過實體顯微鏡收集有三層以上卵丘細胞且胞質均勻、形態良好的卵丘-卵母細胞復合體；

所述卵母細胞體外成熟培養過程具體如下：

1)將未成熟奶山羊卵母細胞放置在成熟培養液I中進行抑制培養抑制其減數分裂6小時；

2)將步驟一中的卵母細胞轉入成熟培養液II中恢復減數分裂進行成熟培養18小時；

3)另取一組未成熟奶山羊卵母細胞，將該未成熟奶山羊卵母細胞放置在常規傳統的成熟培養液中培養24小時；

4)統計未成熟卵母細胞在成熟培養液I中進行抑制培養的減數分裂抑制率以及成熟培養液II中培養的成熟率和后續發育率，將該數據與常規傳統的成熟培養液進行對比，篩選出高效的奶山羊卵母細胞體外成熟培養液；

所述卵母細胞孤雌激活和胚胎的培養：