[發明專利]一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法

有效

• 申請號: 202010192921.8
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111269879B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 魏強;馬保華;張俊鴻;張輝;劉潔;盧四海;馬馳原;姚舸;苗雨陽
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

1.一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法，其特征在于，包括卵巢收集和卵丘-卵母細胞復合體采集、卵母細胞體外成熟培養以及卵母細胞孤雌激活和胚胎的培養；

所述卵巢收集和卵丘-卵母細胞復合體采集過程具體如下：

1)自當地屠宰場采集卵巢；

2)將采集的卵巢放置在22℃～25℃的無菌生理鹽水中，并在3h內運回實驗室；

3)在含有0.1％PVA的mDPBS中收集卵丘-卵母細胞復合體；

4)將卵丘-卵母細胞復合體放置在實體顯微鏡下，通過實體顯微鏡收集有三層以上卵丘細胞且胞質均勻、形態良好的卵丘-卵母細胞復合體；

所述卵母細胞體外成熟培養過程具體如下：

1)將未成熟奶山羊卵母細胞放置在成熟培養液I中進行抑制培養抑制其減數分裂6小時；其中，成熟培養液I成分包括：89％組織培養基199制劑、10％胎牛血清、1％25-800-CR胰島素-轉鐵蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸鈉溶液、適量100ng/ml的C型鈉尿肽以及適量10nmol/L的β-雌二醇；

2)將步驟1）中的卵母細胞轉入成熟培養液II中恢復減數分裂進行成熟培養18小時；其中，成熟培養液II成分包括：89％組織培養基199制劑、10％胎牛血清、適量0.075U/mL的人絕經期促性腺激素、適量1μg/mL的β-雌二醇、適量10ng/mL的表皮細胞生長因子以及1％25-800-CR胰島素-轉鐵蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸鈉溶液；

3)另取一組未成熟奶山羊卵母細胞，將該未成熟奶山羊卵母細胞放置在常規傳統的成熟培養液中培養24小時；

4)統計未成熟卵母細胞在成熟培養液I中進行抑制培養的減數分裂抑制率以及成熟培養液II中培養的成熟率和后續發育率，將該數據與常規傳統的成熟培養液進行對比，篩選出高效的奶山羊卵母細胞體外成熟培養液；

所述卵母細胞孤雌激活和胚胎的培養：

1)將卵丘卵母細胞復合體移入0.1％(w/v)透明質酸酶中作用0.5min；

2)用適當口徑吸管反復吹打，去除卵丘細胞；

3)選擇能觀察到第一極體的成熟卵母細胞；

4)將成熟卵母細胞在5μmol/Lionomycin中室溫處理2min；

5)之后將步驟4）中的成熟卵母細胞放置于SOF培養液中進行洗凈；

6)將洗凈的成熟卵母細胞放置于含2mM6-DMAPSOF中，在38.5℃以及5％CO₂的條件下培養2h；

7)將步驟6）中的成熟卵母細胞放置在不含6-DMAP的SOF中，在38.5℃、5％CO₂以及飽和濕度條件下培養4h；

所述胚胎培養采用SOFaa培養液進行培養，其培養方法具體為：于四孔板的每個培養孔內加入500μL胚胎培養液并覆蓋石蠟油，置于CO₂培養箱中預平衡，將孤雌激活胚胎隨機移入到四孔板的培養孔中，置于38.5℃、5％CO₂以及飽和濕度的培養箱中培養，5d觀察記錄桑葚胚數，6～8d記錄囊胚數。

2.根據權利要求1所述的一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法，其特征在于，卵巢收集和卵丘-卵母細胞復合體采集過程的步驟2）中的無菌生理鹽水中添加有100IU/mL青霉素和0.05mg/mL硫酸鏈霉素。

3.根據權利要求1所述的一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法，其特征在于，卵母細胞體外成熟培養過程中的成熟培養液內每100μL成熟培養液培養25枚卵丘卵母細胞復合體，所述卵母細胞體外成熟培養具體在38.5℃以及5％CO₂環境下培養。

4.根據權利要求1所述的一種高效奶山羊卵母細胞體外培養方法，其特征在于，常規傳統的成熟培養液的成分具體包括：89％組織培養基199制劑、10％胎牛血清、適量0.075U/mL的人絕經期促性腺激素、適量1μg/mL的β-雌二醇、適量10ng/mL的表皮細胞生長因子以及1％25-800-CR胰島素-轉鐵蛋白-硒和0.2mmol/L丙酮酸鈉溶液。