[發明專利]一種基于皮膚前體細胞的提取物及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 202010192592.7
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111297905B
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發明（設計）人: 李利;陳偉;熊麗丹;唐潔;華薇;黎安琪;舒曉紅
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: A61K35/36
• 分類號: A61K35/36;A61P17/00;C12N5/071;A61K8/98;A61K8/60;A61K8/44;A61K8/34;A61K8/67;A61Q19/08
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明公開了一種基于皮膚前體細胞的抗皮膚萎縮的提取物。本發明基于皮膚前體細胞的提取物制備過程中不需要添加胎牛血清，避免了血清中攜帶動物疫病病原體，以及動物源成分可能對皮膚刺激造成的刺激，安全性更高，適合人體使用。動物實驗驗證了本發明皮膚前體細胞培養上清液凍干粉制劑與其他直接添加在化妝品中的細胞類制劑相比，將凍干粉中的有效成分直接注入真皮層，避免了外用涂抹產品透皮吸收困難的缺陷，保證了產品的抗光老化的功效性。

技術領域

本發明一種基于皮膚前體細胞的提取物及其制備方法和用途。

背景技術

萎縮性皮膚病臨床非常常見，如萎縮紋、偏側萎縮、全層萎縮、進行性特發性皮膚萎縮、老化皮膚及皺紋以及若干繼發于其他皮膚病的皮膚萎縮(如痤瘡后的萎縮性疤痕)。諸多萎縮性皮膚病導致患者外觀的變化，進而引起生理、心理及社會生活適應能力方面的巨大痛苦；另一方面，隨著社會的發展，生活水平的顯著提高，人們延緩皮膚衰老的要求也日愈迫切，市場潛力巨大。然而目前國內外對于萎縮性皮膚病卻缺乏滿意的治療藥物，因此尋找有效的治療途徑成為當今的研究熱點。

皮膚前體細胞(skin-derived precursors，SKP)是來源于真皮層的一類多能干細胞，具有向三個胚層的體細胞誘導分化的潛能，具有廣泛的應用前景。研究表明，培養的干細胞的液體中含有多種細胞因子，被皮膚細胞攝取后，可以激活角質細胞和成纖維細胞，矯正角化過度的表皮組織，刺激真皮膠原蛋白的合成，增加皮膚組織的彈性和容量。而目前還沒有以皮膚前體細胞為原料制備的提取物，用于治療萎縮性皮膚病。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種基于皮膚前體細胞的提取物的制備方法，它包括如下步驟：

(1)皮膚前體細胞的分離培養：取新鮮皮膚，消毒清洗，除去脂肪層，剪成塊，加胰酶2～8℃消化8～12h，再加DMEM培養基終止消化，除去表皮，真皮剪成塊，加膠原酶35～40℃消化2～5h，再加DMEM高糖培養基終止消化，解離細胞，細胞懸液接種于增殖培養基中傳代培養；

(2)皮膚前體細胞培養上清液的制備：取步驟1)所得P3-P5代細胞，接種于DMEM/F12培養基中培養72～120h，離心，過濾得上清液；

(3)皮膚前體細胞培養上清液凍干粉的制備：取步驟2)上清液，濃縮，過濾，再加凍存保護劑混勻，過濾，冷凍即得。

進一步地，步驟1)所述皮膚為人的皮膚，優選人包皮；所述消毒是用75％酒精消毒；所述清洗是用PBS緩沖液沖洗3次；所述剪成塊是將皮膚剪成5×5mm²/塊。

進一步地，步驟1)所述加胰酶4℃消化8h；所述胰酶濃度為0.2～0.5％(g/ml)，優選0.25％(g/ml)。

進一步地，步驟1)所述除去表皮是用PBS緩沖液沖洗2次，未洗去的表皮用鑷子手工分離去除；所述真皮剪成塊是將真皮剪成2-3mm²/塊；所述加膠原酶37℃消化2～3h；所述膠原酶濃度為1～3mg/ml，優選1mg/ml；所述解離細胞是用1000μl移液槍反復吹打，機械解離細胞。

進一步地，所述細胞懸液是解離細胞后的上清液經70μm濾網過濾，2000rpm的速度離心8分鐘后的細胞沉淀，加DMEM/F12培養基稀釋至密度為2～4×10⁴/ml的細胞懸液。

進一步地，步驟1)所述傳代培養的方法為：

細胞懸液接種于含2％B27,20ng/ml EGF和40ng/ml bFGF的增殖培養基中,在37℃，5％CO₂條件下培養，每3-4天加1-2ml含有2％B27，20ng/ml EGF和40ng/ml bFGF的無血清洗滌培養基，細胞球中心開始變黑或貼壁時記為P1代細胞，將含P1代細胞球的培養基以1600rmp/min的速度離心后，用DMEM/F12培養基重懸浮后吹打成單個細胞，再按照相同培養方法傳代培養得P3-P5代細胞