[發明專利]一種基于皮膚前體細胞的提取物及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 202010192592.7
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111297905B
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發明（設計）人: 李利;陳偉;熊麗丹;唐潔;華薇;黎安琪;舒曉紅
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: A61K35/36
• 分類號: A61K35/36;A61P17/00;C12N5/071;A61K8/98;A61K8/60;A61K8/44;A61K8/34;A61K8/67;A61Q19/08
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種基于皮膚前體細胞的提取物的制備方法，其特征在于：它包括如下步驟：

（1）皮膚前體細胞的分離培養：取皮膚，消毒清洗，除去脂肪層，剪成塊，加胰酶2~8°C消化 8~12h，再加DMEM培養基終止消化，除去表皮，真皮剪成塊，加膠原酶35~40℃消化2~5h，再加DMEM培養基終止消化，解離細胞，細胞懸液接種于增殖培養基中傳代培養；

所述除去表皮是用PBS緩沖液沖洗2次，未洗去的表皮用鑷子手工分離去除；所述真皮剪成塊是將真皮剪成2-3mm²/塊；所述加膠原酶37℃消化2~3h；所述膠原酶濃度為1~3mg/ml；所述解離細胞是用1000μl移液槍反復吹打，機械解離細胞；所述細胞懸液是解離細胞后的上清液經70 μm濾網過濾， 2000 rpm的速度離心8分鐘后的細胞沉淀，加DMEM/F12培養基稀釋至密度為2~4′10⁴/ml的細胞懸液；

（2）皮膚前體細胞培養上清液的制備：取步驟1）所得P3-P5代細胞，接種于DMEM/F12培養基中培養72h，離心，過濾得上清液；所述P3-P5代細胞用DMEM/F12培養基稀釋至密度為2~4′10⁴/ml；

（3）皮膚前體細胞培養上清液凍干粉的制備：取步驟2）上清液，用5KD超濾濃縮離心管以7000g的離心力超濾離心2小時，用0.22μm細胞濾過器過濾，再加凍存保護劑混勻，過濾，在-80℃預凍24h，再按照下述程序干燥：程序為：

，

即得；

所述凍存保護劑的加入量為濃縮液的1.5~2.0，g/ml倍量；所述凍存保護劑是質量比為10：3：2：0.4：0.2：0.2的甘露醇、右旋糖酐、海藻糖、維生素C、氨基乙酸和甘氨酸組成的混合物；

所述DMEM/F12培養基為不含B27、FGF和EGF的DMEM/F12 3:1培養基。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）所述皮膚為人包皮；所述消毒是用75%酒精消毒；所述清洗是用PBS緩沖液沖洗3次；所述剪成塊是將皮膚剪成5×5 mm²/塊。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）所述加胰酶4°C消化8h；所述胰酶濃度為0.2~0.5%，g/ml。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）所述傳代培養的方法為：細胞懸液接種于含2% B27, 20 ng/ mlEGF和40 ng/ml bFGF的增殖培養基中, 在37℃，5%CO₂條件下培養，每3-4天加1-2ml含有2% B27，20 ng / ml EGF和40 ng/ml bFGF的無血清洗滌培養基，細胞球中心開始變黑或貼壁時記為P1代細胞，將含P1代細胞球的培養基以1600rmp/min的速度離心后，用DMEM/F12培養基重懸浮后吹打成單個細胞，再按照相同培養方法傳代培養得P3-P5代細胞。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）所述新鮮皮膚、胰酶、終止胰酶消化的DMEM培養基、膠原酶、終止膠原酶消化的DMEM培養基質量體積比為10g：3ml:15ml:3ml: 15ml。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟2）所述離心速度1000rpm，時間5min；所述過濾是用0.22μm細胞濾過器過濾。

7.一種改善皮膚萎縮的藥物制劑，其特征在于：它是以權利要求1~6任意一項制備的提取物為活性成分，加入藥學上可接受的輔料制備而成的制劑。

8.根據權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于：所述制劑為注射制劑。

9.權利要求7或8所述的藥物制劑在制備治療皮膚萎縮的藥物中的用途。

10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于，所述藥物是治療光損傷所致皮膚萎縮的藥物。