[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于皮膚前體細(xì)胞的提取物及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010192592.7
• 申請(qǐng)日: 2020-03-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111297905B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李利;陳偉;熊麗丹;唐潔;華薇;黎安琪;舒曉紅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): A61K35/36
• 分類(lèi)號(hào): A61K35/36;A61P17/00;C12N5/071;A61K8/98;A61K8/60;A61K8/44;A61K8/34;A61K8/67;A61Q19/08
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種基于皮膚前體細(xì)胞的提取物的制備方法，其特征在于：它包括如下步驟：

（1）皮膚前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)：取皮膚，消毒清洗，除去脂肪層，剪成塊，加胰酶2~8°C消化 8~12h，再加DMEM培養(yǎng)基終止消化，除去表皮，真皮剪成塊，加膠原酶35~40℃消化2~5h，再加DMEM培養(yǎng)基終止消化，解離細(xì)胞，細(xì)胞懸液接種于增殖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)；

所述除去表皮是用PBS緩沖液沖洗2次，未洗去的表皮用鑷子手工分離去除；所述真皮剪成塊是將真皮剪成2-3mm²/塊；所述加膠原酶37℃消化2~3h；所述膠原酶濃度為1~3mg/ml；所述解離細(xì)胞是用1000μl移液槍反復(fù)吹打，機(jī)械解離細(xì)胞；所述細(xì)胞懸液是解離細(xì)胞后的上清液經(jīng)70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾， 2000 rpm的速度離心8分鐘后的細(xì)胞沉淀，加DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至密度為2~4′10⁴/ml的細(xì)胞懸液；

（2）皮膚前體細(xì)胞培養(yǎng)上清液的制備：取步驟1）所得P3-P5代細(xì)胞，接種于DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h，離心，過(guò)濾得上清液；所述P3-P5代細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至密度為2~4′10⁴/ml；

（3）皮膚前體細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉的制備：取步驟2）上清液，用5KD超濾濃縮離心管以7000g的離心力超濾離心2小時(shí)，用0.22μm細(xì)胞濾過(guò)器過(guò)濾，再加凍存保護(hù)劑混勻，過(guò)濾，在-80℃預(yù)凍24h，再按照下述程序干燥：程序?yàn)椋?/p>

，

即得；

所述凍存保護(hù)劑的加入量為濃縮液的1.5~2.0，g/ml倍量；所述凍存保護(hù)劑是質(zhì)量比為10：3：2：0.4：0.2：0.2的甘露醇、右旋糖酐、海藻糖、維生素C、氨基乙酸和甘氨酸組成的混合物；

所述DMEM/F12培養(yǎng)基為不含B27、FGF和EGF的DMEM/F12 3:1培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）所述皮膚為人包皮；所述消毒是用75%酒精消毒；所述清洗是用PBS緩沖液沖洗3次；所述剪成塊是將皮膚剪成5×5 mm²/塊。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）所述加胰酶4°C消化8h；所述胰酶濃度為0.2~0.5%，g/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）所述傳代培養(yǎng)的方法為：細(xì)胞懸液接種于含2% B27, 20 ng/ mlEGF和40 ng/ml bFGF的增殖培養(yǎng)基中, 在37℃，5%CO₂條件下培養(yǎng)，每3-4天加1-2ml含有2% B27，20 ng / ml EGF和40 ng/ml bFGF的無(wú)血清洗滌培養(yǎng)基，細(xì)胞球中心開(kāi)始變黑或貼壁時(shí)記為P1代細(xì)胞，將含P1代細(xì)胞球的培養(yǎng)基以1600rmp/min的速度離心后，用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸浮后吹打成單個(gè)細(xì)胞，再按照相同培養(yǎng)方法傳代培養(yǎng)得P3-P5代細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）所述新鮮皮膚、胰酶、終止胰酶消化的DMEM培養(yǎng)基、膠原酶、終止膠原酶消化的DMEM培養(yǎng)基質(zhì)量體積比為10g：3ml:15ml:3ml: 15ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟2）所述離心速度1000rpm，時(shí)間5min；所述過(guò)濾是用0.22μm細(xì)胞濾過(guò)器過(guò)濾。

7.一種改善皮膚萎縮的藥物制劑，其特征在于：它是以權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)制備的提取物為活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物制劑，其特征在于：所述制劑為注射制劑。

9.權(quán)利要求7或8所述的藥物制劑在制備治療皮膚萎縮的藥物中的用途。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述藥物是治療光損傷所致皮膚萎縮的藥物。