[發明專利]用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻及其構建方法、應用

有效

• 申請號: 202010186754.6
• 申請日: 2020-03-17
• 公開（公告）號: CN111454976B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 婁素琳;胡章立;黃思敏;林鑫
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N15/82;C12N15/66;C12N1/13;C12N9/90;C12R1/89
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙) 44268
• 代理人: 徐凱凱;劉芙蓉

本發明提供一種用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻及其構建方法、應用，所述構建方法通過擴增得到普通小球藻的番茄紅素ε?環化酶基因，構建所述番茄紅素ε?環化酶基因重組表達載體；將所述番茄紅素ε?環化酶基因重組表達載體轉化至萊茵衣藻細胞中，得到轉番茄紅素ε?環化酶基因萊茵藻。所得到的轉基因衣藻能夠高產葉黃素，利用藻類無性繁殖、生長快速的特點，因此可以低成本，快速地獲取葉黃素。

技術領域

本發明涉及生物基因工程技術領域，特別涉及一種用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻及其構建方法、應用。

背景技術

葉黃素最顯著的生物活性是其抗氧化特性。葉黃素能被氧化劑迅速氧化，從而減小細胞內自由基等其他物質被氧化的幾率，從而實現對機體的抗氧化保護。與其他類胡蘿卜素成員相似，葉黃素的抗氧化能力歸功于其共軛碳雙鍵系統。該結構允許單線態氧的猝滅和自由基的清除。因為它超強的抗氧化特性，它是維持和促進人們身體健康的的一類營養素，并且越來越多的證據支持它們在預防或延遲慢性疾病方面的保護作用。

葉黃素廣泛分布于水果，蔬菜和花卉中，其中萬壽菊花是迄今為止商業葉黃素最豐富的天然來源。然而，萬壽菊葉中存在的大量葉黃素被酯化，其重量的一半都是脂肪酸，因此，化學皂化在葉黃素產品的制造中是必需。此外，萬壽菊葉黃素的產量也受季節，種植面積和高人力成本的限制。普通小球藻作為天然葉黃素提取常用材料之一，日漸受到重視和深入研究。

目前普通小球藻提高葉黃素提取量的手段主要包括優化提取方法、優化培養條件等，由于普通小球藻遺傳轉化體系不穩定，不利于通過基因工程手段改造提高葉黃素產量。相對與普通小球藻，萊茵衣藻具有遺傳體系穩定、遺傳背景清晰及藻胞內足夠存儲代謝產物場所的條件，是一個公認的良好細胞工廠。例如，Cordero等將C.zofingiensis的PSY基因轉化至萊茵衣藻中，獲得一株葉黃素含量顯著提高的萊茵衣藻轉化子(Cordero B F，Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91(2)：341-351)。因此本發明將通過綠藻模式生物萊茵衣藻進行改造，以期獲得一株高表達葉黃素轉基因萊茵衣藻工程藻株。

本發明將對萊茵衣藻進行基因工程改造，將含有普通小球藻葉黃素合成途徑中的關鍵基因CvLCYE的重組質粒轉化至萊茵衣藻，在萊茵衣藻中過表達CvLCYE，提高萊茵衣藻葉黃素含量，為實現萊茵衣藻生產葉黃素可產業化奠定基礎。

故此，亟需獲得一株高表達葉黃素轉基因萊茵衣藻工程藻株

發明內容

針對現有技術的不足，本發明旨在提供用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻及其構建方法、應用。

本發明所采用的技術方案如下：

一種用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻的構建方法，其中，其包括：

擴增得到普通小球藻的番茄紅素ε-環化酶基因，構建所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體；

將所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體轉化至萊茵衣藻細胞中，得到轉番茄紅素ε-環化酶基因萊茵衣藻。

所述的用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻的構建方法，其中，所述番茄紅素ε-環化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻的構建方法，其中，所述番茄紅素ε-環化酶基因為人工轉化番茄紅素ε-環化酶基因。

所述的用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻的構建方法，其中，所述構建所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體，具體包括：

對番茄紅素ε-環化酶-T載體、pH124空載體進行雙酶切，得到目的片段番茄紅素ε-環化酶基因和線性化質粒pH124，用T4 DNA連接酶進行連接，得到番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體。