[發明專利]用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻及其構建方法、應用

有效

• 申請號: 202010186754.6
• 申請日: 2020-03-17
• 公開（公告）號: CN111454976B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 婁素琳;胡章立;黃思敏;林鑫
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N15/82;C12N15/66;C12N1/13;C12N9/90;C12R1/89
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙) 44268
• 代理人: 徐凱凱;劉芙蓉

1.一種用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻的構建方法，其特征在于，其包括：

擴增得到普通小球藻的番茄紅素ε-環化酶基因，構建所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體；

將所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體轉化至萊茵衣藻細胞中，得到轉番茄紅素ε-環化酶基因萊茵衣藻；

所述番茄紅素ε-環化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述構建所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體，具體包括：

對番茄紅素ε-環化酶-T載體、pH124空載體進行雙酶切，得到目的片段番茄紅素ε-環化酶基因和線性化質粒pH124；

將得到目的片段番茄紅素ε-環化酶基因和線性化質粒pH124，用T4 DNA連接酶進行連接，連接反應結束后，將連接產物與大腸桿菌感受態細胞混合冰上放置，加入無抗LB培養基，搖床復蘇，復蘇菌液涂布氨芐青霉素抗性平板；倒置培養過夜,得到轉化子；

對所述轉化子用新抗性平板二篩，二篩后的轉化子菌落進行PCR擴增，得到番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體；

所述將所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體轉化至萊茵衣藻細胞中，得到轉番茄紅素ε-環化酶基因萊茵衣藻，包括：

將所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體用限制性內切酶NotI進行單酶切使其線性化；將線性化番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體轉化至萊茵衣藻細胞中，得到轉番茄紅素ε-環化酶基因萊茵藻；

所述番茄紅素ε-環化酶基因含7個外顯子，6個內含子；

所述番茄紅素ε-環化酶-T載體、pH124空載體進行雙酶切的反應體系為：酶切buffer 2μL、Eco72I 1 μL、NheI 1μL、番茄紅素ε-環化酶-T載體或pH124空載體 1 μg、無菌水 Up to20μL；

所述將得到目的片段番茄紅素ε-環化酶基因和線性化質粒pH124，用T4 DNA連接酶進行連接，其中，連接體系為：番茄紅素ε-環化酶基因與載體的摩爾比1:1-1:5、線性化質粒pH124 20-100 ng、10X T4 DNA Ligase Buffer 2 μL、T4 DNA Ligase 0.2 μL、無菌水 Upto 20μL。

2.根據權利要求 1 所述的用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻的構建方法，其特征在于，所述番茄紅素ε-環化酶基因為人工轉化番茄紅素ε-環化酶基因。

3.根據權利要求 1 所述的用于提高萊茵衣藻葉黃素含量的轉基因衣藻的構建方法，其特征在于，所述將所述番茄紅素ε-環化酶基因重組表達載體轉化至萊茵衣藻細胞中，其中轉化方法為珠磨法。

4.一種普通小球藻的番茄紅素ε-環化酶，其特征在于，由番茄紅素ε-環化酶基因編碼得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。