[發明專利]一種兼容不同實驗條件及下游應用的環境DNA提取方法

在審

• 申請號: 202010186260.8
• 申請日: 2020-03-17
• 公開（公告）號: CN111269965A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 周克茹;單鍇;孫蓓麗;陳志偉;吳夢昊
• 申請（專利權）人: 江蘇宏眾百德生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 南京禾易知識產權代理有限公司 32320
• 代理人: 張松云

本發明涉及一種兼容不同實驗條件及下游應用的環境DNA提取方法，包括，采集環境樣本，每份樣本含10⁶～10⁸個細胞；樣本裂解，在每份樣本中加入堿裂解液0.65～0.75ml和ProteaseK溶液65～75μl，充分混勻，96±2℃反應1小時，加入0.65～0.75ml Tris HCl，提取粗純度DNA上清液。本發明提供了一種高效快速的環境DNA提取方法，同時可以滿足野外實驗條件下和實驗室條件下的DNA提取工作，并得到可用于不同下游實驗的DNA；且提取的環境DNA完整度較好且能夠直接用于PCR擴增，在環境水體樣本的16S V4區中擴增出250bp左右目的基因片段，無非特異性擴增。

技術領域

本發明涉及環境樣本的DNA提取技術領域，尤其涉及一種兼容不同實驗條件及下游應用的環境DNA提取方法，屬于生物技術領域。

背景技術

生物監測是環境監測的重要組成部分。分子監測技術相比于傳統監測方法能夠精確反映環境中的生物多樣性，并且有效捕捉環境中的痕量生物殘留。對環境DNA的分析是分子監測的核心步驟，而不同的DNA分析技術對于樣本質量有不同的要求。例如16S測序技術對DNA完整度要求不高但要求盡量去除PCR抑制成分；宏基因組測序則對DNA的完整度有很高的要求；而應急現場快速檢測則要求對樣本DNA的快速提取。除了對樣本的要求，在不同的實驗條件，如野外、流動監測站、基層監測站和中心監測站等，可用于DNA提取與分析的實驗設備也不同。因此，需要一種靈活的DNA提取方案可以兼容多種實驗條件提取環境DNA并且可以以最便捷高效的方法制備適用于不用分析技術的DNA。

發明內容

本發明的目的在于提供一種兼容不同實驗條件及下游應用的環境DNA提取方法，解決生物監測對野外現場快速提取DNA的要求，所有生物細胞的充分裂解是保證獲取完整生物多樣性基因組的重要步驟，堿裂解法可以高效裂解各種生物細胞，釋放DNA，提高環境DNA提取的完整性；溫和裂解法能夠保證在室溫條件下的裂解效率，在缺少恒溫設備的條件下配合酚氯仿異戊醇能獲得較高的基因組完整性。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種兼容不同實驗條件及下游應用的環境DNA提取方法，包括，

步驟一，采集環境樣本，每份樣本含106～108個細胞；

步驟二，樣本裂解，在每份樣本中加入堿裂解液0.65～0.75ml和ProteaseK溶液65～75

μl，充分混勻，96±2℃反應1小時，加入0.65～0.75ml Tris HCl，提取粗純度DNA上清液。

進一步地，以步驟二所得粗純度DNA上清液進行純化，獲取高純度DNA樣本的具體步驟為：

DNA抽提：加入與粗純度DNA上清液等體積的酚氯仿異戊醇溶液，混勻，6，000～7，000g離心10min，保留水相溶液；

DNA沉淀：在水相溶液中加入水相溶液0.6倍體積的預冷異丙醇，顛倒混勻，12,000～13,000g離心5min，棄上清；

DNA洗滌：加入0.8～1ml 70％乙醇洗滌DNA，12,000～13,000g離心1min，棄上清，重復洗滌兩次；室溫晾干5～10min，40～60μl雙蒸水重懸DNA，得到高純度DNA樣本。

進一步地，以步驟二所得的上清液進行純化，獲取高純度DNA樣本的具體步驟為：