[發(fā)明專利]一種兼容不同實(shí)驗(yàn)條件及下游應(yīng)用的環(huán)境DNA提取方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010186260.8
• 申請日: 2020-03-17
• 公開（公告）號: CN111269965A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周克茹;單鍇;孫蓓麗;陳志偉;吳夢昊
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇宏眾百德生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 南京禾易知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32320
• 代理人: 張松云

1.一種兼容不同實(shí)驗(yàn)條件及下游應(yīng)用的環(huán)境DNA提取方法，其特征在于包括，

步驟一，采集環(huán)境樣本，每份樣本含10⁶～10⁸個(gè)細(xì)胞；

步驟二，樣本裂解，在每份樣本中加入堿裂解液0.65～0.75ml和ProteaseK溶液65～75μl，充分混勻，96±2℃反應(yīng)1小時(shí)，加入0.65～0.75ml Tris HCl，提取粗純度DNA上清液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境DNA提取方法，其特征在于，以步驟二所得粗純度DNA上清液進(jìn)行純化，獲取高純度DNA樣本的具體步驟為：

DNA抽提：加入與粗純度DNA上清液等體積的酚氯仿異戊醇溶液，混勻，6,000～7,000g離心10min，保留水相溶液；

DNA沉淀：在水相溶液中加入水相溶液0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，12,000～13,000g離心5min，棄上清；

DNA洗滌：加入0.8～1ml 70％乙醇洗滌DNA，12,000～13,000g離心1min，棄上清，重復(fù)洗滌兩次；室溫晾干5～10min，40～60μl雙蒸水重懸DNA，得到高純度DNA樣本。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境DNA提取方法，其特征在于：以步驟二所得的上清液進(jìn)行純化，獲取高純度DNA樣本的具體步驟為：

將DNA吸附柱放入1.5ml EP管中，上清液700～800μl加入DNA吸附柱，12,000～13,000g離心1min，棄去流出液，兩次加入700～800μl洗滌液，12,000～13,000g離心1min，棄去流出液；將DNA吸附柱放于新1.5ml EP管中，向DNA吸附柱中加入10mmol/L Tris HCl 50μl，12,000～13,000g離心1min，收集流出液，-20℃保存，得到高純度DNA樣本。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境DNA提取方法，其特征在于：所述環(huán)境樣本包括水樣本、土壤樣本、漁網(wǎng)樣本，其中，水樣本經(jīng)0.22μm無菌膜過濾，收集濾膜并剪碎備用；土壤樣本，去除明顯雜質(zhì)即可備用；漁網(wǎng)樣本破碎備用。

5.一種兼容不同實(shí)驗(yàn)條件及下游應(yīng)用的環(huán)境DNA提取方法，其特征在于包括，

步驟一，采集環(huán)境樣本，每份樣本含10⁶～10⁸個(gè)細(xì)胞；

步驟二，樣本裂解，在樣本中加入溫和裂解液4.5ml～5ml，ProteaseK溶液180～200μl，充分混勻后，62±2℃反應(yīng)1h加入NaCl溶液750～800μl，充分混勻，加入CTAB溶液750～800μl，室溫反應(yīng)30～40min；

步驟三，樣本抽提，加入與上清等體積的酚氯仿異戊醇溶液，混勻，6,000～7,000g離心10min，提取粗純度DNA上清液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的兼容不同實(shí)驗(yàn)條件及下游應(yīng)用的環(huán)境DNA提取方法，其特征在于，以步驟三所得粗純度DNA上清液進(jìn)行純化，獲取高純度DNA樣本的具體步驟為：

DNA沉淀：在水相溶液中加入水相溶液0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，12,000～13,000g離心5min，棄上清；

DNA洗滌：加入0.8～1ml 70％乙醇洗滌DNA，12,000～13,000g離心1min，棄上清，重復(fù)洗滌兩次；室溫晾干5～10min，40～60μl雙蒸水重懸DNA，得到高純度DNA樣本。