[發(fā)明專利]活性提高的磷酸轉(zhuǎn)酮酶及在生產(chǎn)代謝物中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010186134.2
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN111411093B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫際賓;李慶剛;鄭平;周文娟;張曉立;德萊奧西班喬·泰沃;馬延和
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C07K19/00;C12P21/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 何葉喧

本發(fā)明公開了活性提高的磷酸轉(zhuǎn)酮酶及在生產(chǎn)代謝物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的突變體蛋白：將磷酸轉(zhuǎn)酮酶進(jìn)行如下突變得到的蛋白質(zhì)：對應(yīng)于序列3的第260位氨基酸殘基由H突變?yōu)閅；對應(yīng)于序列3的第260位氨基酸殘基由H突變?yōu)閅，第2位氨基酸殘基由T突變?yōu)锳；對應(yīng)于序列3的第260位氨基酸殘基由H突變?yōu)閅，第6位氨基酸殘基由I突變?yōu)門；對應(yīng)于序列3的第260位氨基酸殘基由H突變?yōu)閅，第2位氨基酸殘基由T突變?yōu)锳，第6位氨基酸殘基由I突變?yōu)門。本發(fā)明還保護(hù)突變體蛋白在制備代謝物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有磷酸轉(zhuǎn)酮酶相比，本發(fā)明提供的突變體蛋白的磷酸轉(zhuǎn)酮酶酶活顯著增加，進(jìn)而顯著提高目標(biāo)代謝物的產(chǎn)量。

本申請為申請?zhí)枮椤?01910359888.0”、申請日為2019年04月30日，發(fā)明名稱為“活性提高的磷酸轉(zhuǎn)酮酶及在生產(chǎn)代謝物中的應(yīng)用”的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及活性提高的磷酸轉(zhuǎn)酮酶，以及該磷酸轉(zhuǎn)酮酶在生產(chǎn)代謝物中的應(yīng)用，涉及的代謝物包括但不限于氨基酸(特別是源自乙酰輔酶A的氨基酸)、琥珀酸、檸檬酸等。

背景技術(shù)

氨基酸、有機(jī)酸，是人類和動(dòng)物營養(yǎng)中最重要的成分，在醫(yī)藥、健康、食品、化工、動(dòng)物飼料和化妝品等行業(yè)中有著十分重要的地位。當(dāng)前，氨基酸、有機(jī)酸主要采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)，已知的可生產(chǎn)氨基酸的微生物包括埃希氏菌屬(Escherichia)，棒桿菌屬(Corynebavterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)等。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程手段對菌株進(jìn)行遺傳改造，已經(jīng)獲得了大量的高效的氨基酸、有機(jī)酸生產(chǎn)工程菌株。

磷酸轉(zhuǎn)酮酶(phosphoketolase，F(xiàn)/XPK)，包括6-磷酸果糖轉(zhuǎn)酮酶(FPK)和5-磷酸木酮糖轉(zhuǎn)酮酶(XPK)。6-磷酸果糖轉(zhuǎn)酮酶催化的反應(yīng)為：果糖-6-磷酸(F6p)+Pi→乙酰磷酸(AcP)+赤蘚糖-4-磷酸(E4P)。5-磷酸木酮糖轉(zhuǎn)酮酶催化的反應(yīng)為：木酮糖-5-磷酸(X5p)+pi→乙酰磷酸(AcP)+甘油醛-3-磷酸(G3P)。磷酸轉(zhuǎn)酮酶催化的反應(yīng)能夠減少葡萄糖的氧化，但是通常使用的多種基因工程出發(fā)菌株(包括大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌等)，都不存在F/XPK，在這些菌株中引入F/XPK，能夠增加源自乙酰輔酶A的代謝物的理論轉(zhuǎn)化率。天然的F/XPK酶活性較低，需要大量過表達(dá)才能體現(xiàn)出效果，限制了其應(yīng)用潛力。因此，本領(lǐng)域急需開發(fā)酶活性高的磷酸轉(zhuǎn)酮酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供活性提高的磷酸轉(zhuǎn)酮酶及在生產(chǎn)代謝物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為突變體蛋白，為將磷酸轉(zhuǎn)酮酶進(jìn)行如下(a1)至(a12)中任意一種或多種突變得到的蛋白質(zhì)：

(a1)對應(yīng)于序列3的第2位氨基酸殘基由T突變?yōu)锳；

(a2)對應(yīng)于序列3的第6位氨基酸殘基由I突變?yōu)門；

(a3)對應(yīng)于序列3的第14位氨基酸殘基由N突變?yōu)镈；

(a4)對應(yīng)于序列3的第20位氨基酸殘基由E突變?yōu)镈；

(a5)對應(yīng)于序列3的第120位氨基酸殘基由T突變?yōu)锳；

(a6)對應(yīng)于序列3的第231位氨基酸殘基由E突變?yōu)镵；

(a7)對應(yīng)于序列3的第260位氨基酸殘基由H突變?yōu)閅；

(a8)對應(yīng)于序列3的第342位氨基酸殘基由E突變?yōu)镵；

(a9)對應(yīng)于序列3的第397位氨基酸殘基由K突變?yōu)镽；

(a10)對應(yīng)于序列3的第676位氨基酸殘基由D突變?yōu)镚；

(a11)對應(yīng)于序列3的第785位氨基酸殘基由F突變?yōu)長；

(a12)對應(yīng)于序列3的第801位氨基酸殘基由W突變?yōu)镽。