[發(fā)明專利]基于綠色熒光蛋白的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010184473.7
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN113406331A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周選圍;毛培文;黎劉定吉;楊懷昊
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/70;C12N15/65;C12N15/12
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

一種基于綠色熒光蛋白的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，通過克隆出包含如Seq ID No.1所示的綠色熒光蛋白基因的載體pUC57?GFP后，將其與pET?30a載體序列重組得到重組質(zhì)粒pET?GFP，進(jìn)一步與如Seq ID No.5所示的glu1基因序列重組得到重組質(zhì)粒pET?glu1?GFP，再基于重組質(zhì)粒構(gòu)建pET?glu1?GFP原核表達(dá)菌株，經(jīng)培養(yǎng)得到用于定位真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞的glu1?GFP重組蛋白。本發(fā)明利用綠色熒光蛋白對真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位，能夠準(zhǔn)確、快速的鑒定出蛋白質(zhì)是否進(jìn)入細(xì)胞，為真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白生物活性的探索提供了更加廣闊的前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種生物工程領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種基于綠色熒光蛋白的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法。

背景技術(shù)

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)最初是從水母中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，當(dāng)水母發(fā)光蛋白結(jié)合Ca²⁺后發(fā)出藍(lán)色熒光，該藍(lán)光進(jìn)一步激發(fā)GFP產(chǎn)生綠色熒光。GFP激發(fā)后發(fā)出的熒光持續(xù)時間較長，且不需要任何其他輔助因子的作用，GFP的cDNA成功克隆及在大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞中成功表達(dá)后，人們認(rèn)識到它巨大的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)應(yīng)用于蛋白表達(dá)、病原菌侵染監(jiān)控和細(xì)胞定位等過程，是監(jiān)測活細(xì)胞和組織內(nèi)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位的理想探針。已被廣泛地用作報告基因，進(jìn)行活體的細(xì)胞學(xué)實驗研究。

真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(fungal immunomodulatory protein,FIP)是分離于高等擔(dān)子菌中一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的小分子蛋白質(zhì)。FIP家族的蛋白質(zhì)具有抗腫瘤、抗過敏、刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子等多種免疫調(diào)節(jié)作用，具有良好的藥用保健價值和應(yīng)用前景(Li QZ et al.,Fungal Immunomodulatory Proteins:Characteristic,Potential Anti-Tumor Activities and Their Molecular Mechanisms.Drug discovery today,2019,24:307-314.)。巨噬細(xì)胞屬于單核吞噬細(xì)胞，能夠產(chǎn)生大量的促炎性或抗炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而引起免疫應(yīng)答,常被用作評價天然產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞模型。現(xiàn)有研究表明重組FIP-glu是一種潛在的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖和激活的刺激因子，能夠在mRNA水平上調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的促炎性和抗炎性介質(zhì)，能夠通過PI3K和MAPKs途徑介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的激免疫調(diào)節(jié)功能。(Li QZ,et al.,Immunomodulatory activity of Ganoderma lucidum immunomodulatoryprotein via PI3K/Akt and MAPK signaling pathways in RAW264.7 cells.J CellPhysiol.2019,234:23337-23348)。

探究真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白對巨噬細(xì)胞的生物活性時，鑒定蛋白是否進(jìn)入巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用是首要步驟。現(xiàn)有的蛋白細(xì)胞定位方法主要有免疫熒光技術(shù)、免疫膠體金標(biāo)記和融合報告基因等。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)原理，將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原。用這種方法雖然可以得到細(xì)胞中目的蛋白的大致分布情況，但是得到的圖像是整個細(xì)胞中熒光信號的疊加，得不到較高的分辨率，不適用于細(xì)胞內(nèi)蛋白定位的研究。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電的性質(zhì)，使其與抗體相吸引，從而將抗體標(biāo)記。這種方法可以非常精確地反映不同蛋白在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的精確地位，但這種方法操作相當(dāng)復(fù)雜，需要的時間和成本都很高。