[發(fā)明專利]基于綠色熒光蛋白的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202010184473.7 | 申請(qǐng)日： | 2020-03-16 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN113406331A | 公開（公告）日： | 2021-09-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 周選圍;毛培文;黎劉定吉;楊懷昊 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 上海交通大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | G01N33/68 | 分類號(hào)： | G01N33/68;C12N15/70;C12N15/65;C12N15/12 |
| 代理公司： | 上海交達(dá)專利事務(wù)所 31201 | 代理人： | 王毓理;王錫麟 |
| 地址： | 200240 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 基于 綠色 熒光 蛋白 真菌 免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞 定位 方法 | ||
1.一種基于綠色熒光蛋白的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，其特征在于，通過克隆出包含如Seq ID No.1所示的綠色熒光蛋白基因的載體pUC57-GFP后，將其與pET-30a載體序列重組得到重組質(zhì)粒pET-GFP，進(jìn)一步與如Seq ID No.5所示的glu1基因序列重組得到重組質(zhì)粒pET-glu1-GFP，再基于重組質(zhì)粒構(gòu)建pET-glu1-GFP原核表達(dá)菌株，經(jīng)培養(yǎng)得到用于定位真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞的glu1-GFP重組蛋白；
所述的重組質(zhì)粒pET-GFP的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，其特征是，所述的重組質(zhì)粒pET-GFP，經(jīng)轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞并通過菌落PCR以鑒定重組質(zhì)粒準(zhǔn)確性；
所述的重組質(zhì)粒pET-glu1-GFP的核苷酸序列如Seq ID No.8所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，其特征是，所述的原核表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，其特征是，所述的glu1-GFP重組蛋白，經(jīng)過純化處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，其特征是，所述的定位真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞是指：通過包含glu1-GFP重組蛋白的培養(yǎng)基對(duì)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使得包含熒光的glu1-GFP重組蛋白進(jìn)行真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，其特征是，所述的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞，采用巨噬細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一所述的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，其特征是，所述的定位方法具體包括：
步驟1)根據(jù)綠色熒光蛋白的基因序列，設(shè)計(jì)合成綠色熒光蛋白基因，將基因克隆在pUC-57載體中，得到pUC57-GFP；
步驟2)根據(jù)綠色熒光蛋白和pET-30a載體基因序列，用BamH I和Not I酶切pUC57-GFP和pET-30a載體質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物連接，獲得重組質(zhì)粒pET-GFP，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；
步驟3)用引物T7和T7t對(duì)重組質(zhì)粒pET-GFP進(jìn)行菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒準(zhǔn)確性；
步驟4)根據(jù)pET-GFP重組載體序列和glu1基因序列，用Nde I和BamH I酶切pET-GFP重組載體和glu1基因，將酶切產(chǎn)物連接，獲得重組質(zhì)粒pET-glu1-GFP；
步驟5)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pET-glu1-GFP大腸桿菌原核表達(dá)菌株；
步驟6)將大腸桿菌陽性單克隆菌落在LBKan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得rFIP-glu1-GFP重組蛋白并純化；
步驟7)對(duì)rFIP-glu1-GFP重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)；
步驟8)用rFIP-glu1-GFP重組蛋白處理巨噬細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察重組蛋白，進(jìn)行細(xì)胞定位。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中任一所述的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞定位方法，其特征是，所述的LBKan液體培養(yǎng)基的含量組分為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，卡那霉素25μg/mL。
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