[發明專利]一種用于表達LA16C-313D11.11的序列及其構建體和構建方法與應用

在審

• 申請號: 202010184078.9
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN111454957A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 辛衛娟
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬婦產科醫院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12N15/66;A61K48/00;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 天津市尚儀知識產權代理事務所(普通合伙) 12217
• 代理人: 王山

1.一種用于表達LA16C-313D11.11的序列，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.1所示。

2.一種構建體，其特征在于，該構建體包括質粒載體EcoRI和BamHI限制性上下游酶切位點之間的如SEQ ID NO.1所示DNA序列，構建體序列為SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求2所述的構建體，其特征在于：LA16C-313D11.11的過表達質粒為：

pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-LncRNA(LA16C-313D11.11)。

4.根據權利要求3所述的構建體，其特征在于：質粒載體為H145。

5.一種權利要求2所述構建體的構建方法，包括：

A、目的基因片段的獲得，通過PCR進行擴增方式或通過酶切方式得到目的基因；

其中通過PCR進行擴增得到目的基因的方式中，使用高保真的PrimeSTAR酶擴增目的基因，反應體系和條件如下：

按下列組分配制PCR反應液：

PCR反應條件設置如下：

PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，并把目的基因條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收；

通過酶切得到目的基因的方式中：

用限制性內切酶對含有目的基因的質粒進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg，10x反應Buffer 5μL，限制性內切酶各1μL，用水補足50μL，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并把目的基因條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0做膠回收；

B、線性化表達載體的制備，用限制性內切酶對表達載體進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg，10x反應Buffer 5μL，限制性內切酶各1μL，用水補足50μL，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收；

C、目的基因構建入線性化表達載體中，使用無縫克隆試劑盒、無縫組裝試劑盒和使用T4 DNA連接酶中任意一種方式將目的基因構建入線性化表達載體；

其中使用無縫克隆試劑盒的方式中，將目的基因片段和線性化載體以摩爾比2:1加到離心管中進行重組反應，各組分為：

總體積為20μL

最適插入片段使用量＝[0.04x插入片段堿基數]ng(0.03pmol)，

最適線性化載體使用量＝[0.02x線性化載體堿基數]ng(0.03pmol)，

混勻后在37℃孵育30分種，然后轉移到冰上放置5分鐘。直接轉化或者置于-20℃保存等需要轉化時解凍轉化；

使用無縫組裝試劑盒的方式中，將目的基因片段和線性化載體以摩爾比1:1加到離心管中進行重組反應，分組分為：

總體積為20μL

最適插入片段使用量＝[0.02x插入片段堿基數]ng(0.03pmol)，

最適線性化載體使用量＝[0.02x線性化載體堿基數]ng(0.03pmol)，

混勻后在37℃孵育30分種，然后轉移到冰上放置5分鐘。直接轉化或者置于-20℃保存等需要轉化時解凍轉化；

使用T4DNA連接酶的方式中：

將目的基因片段和線性化載體以摩爾比3:1加到離心管中進行連接反應。線性化的表達載體一般加入100ng，目的基因片段加入量為300x目的基因堿基對數/線性化的表達載體堿基對數(單位ng)，各組分為；

混勻后在16℃連接過夜，取10μL反應液體轉化到感受態細胞中；

D、DH5α感受態細胞的制備和轉化；

E、菌落PCR鑒定陽性轉化子：

挑取平板上長出的轉化子重懸于10μL LB培養液中，取1μL作為模板進行菌落PCR鑒定，反應體系和PCR循環條件如下：

PCR反應液組成為：

PCR反應條件為：

F、陽性克隆送測序。

6.一種權利要求2所述構建體在抑制子宮內膜癌中的應用。