[發明專利]基于微滴式數字PCR的EB病毒檢測試劑盒

有效

• 申請號: 202010183957.X
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN111041131B
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 羅景燕;許少飛;李偉琴;賴炳權;張鈺瑩;曹紅豆;何繼謙
• 申請（專利權）人: 廣東永諾醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 廣州厚海專利商標代理事務所(普通合伙) 44662
• 代理人: 梁桂萍

本申請公開一種基于微滴式數字PCR的EB病毒檢測試劑盒，所述試劑盒包括:微滴式數字PCR用反應預混液；目的片段檢測混合液，包括目的片段的擴增引物和探針，目的片段的擴增引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，目的片段的探針的序列如SEQ ID No.3所示；內標及內標檢測混合液，包括作為內標的外源重組質粒，以及所述內標的擴增引物和探針，內標的擴增引物的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，內標的探針的序列如SEQ ID No.6所示；陽性對照預混液；陰性對照預混液；本申請優化利用數字PCR技術針對EB病毒進行絕對定量檢測的成品試劑盒，為EB病毒相關疾病診斷提供準確的診斷依據。

技術領域

本申請涉及生物技術領域，尤其涉及一種基于微滴式數字PCR的EB病毒檢測試劑盒。

背景技術

EB病毒(epstein-barr virus,EBv)，又稱人類皰疹病毒4型(Human herpesvirus4 (HHV-4))。EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地將Burkitt非洲兒童淋巴瘤細胞通過體外懸浮培養而建株，并在建株細胞涂片中用電鏡觀察到皰疹病毒顆粒，認為該病毒是多種惡性腫瘤(如Burkitt 淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等)的病因之一，它主要感染人類口咽部的上皮細胞和B淋巴細胞。

鼻咽癌是我國南方及東南沿海地區高發的頭頸部惡性腫瘤，全世界約 80%的鼻咽癌都發生在我國，嚴重威脅人民的生命健康。鼻咽癌對放射治療比較敏感，隨著放療技術的不斷發展，早期鼻咽癌的 5 年生存率已高達 95%。但在臨床實踐中，由于鼻咽癌發病部位隱匿，發病癥狀與其他良性疾病難以鑒別，大部分鼻咽癌患者確診時已處于中晚期，伴隨頸部淋巴結和或遠處轉移，轉移和復發風險顯著升高，死亡率急劇上升。因此，提高鼻咽癌的早期診斷和預后判斷水平是提升鼻咽癌整體治療水平的有效途徑。鼻咽癌標志物的開發、應用、評價和完善是實現上述目標的關鍵步驟。

國內首個《鼻咽癌標志物臨床應用專家共識》指出：血漿EBV DNA篩查可以顯著提高鼻咽癌的早診率，從而相應地提高療效，在鼻咽癌高發區，推薦將EBV DNA檢測作為鼻咽癌早期篩查的常規項目；治療前后血漿EBV DNA水平的變化可用于鼻咽癌療效判斷的依據；綜合考慮治療全程的血漿EBV DNA水平和TNM分期，可更加準確地判斷預后，為腫瘤治療后進展提供早期干預依據。

實時熒光定量PCR技術是目前EBV DNA檢測應用最廣泛的技術。由于可以實現快速、靈敏檢測，大量文獻證實熒光定量PCR檢測 EBV-DNA 對鼻咽癌的診斷、治療方案的選擇、療效判定及預后意義重大。但由于不同實驗室PCR平臺間缺少統一的檢測執行標準，無論是樣本類型、DNA提取方法、檢測的DNA 片段、質量控制、檢測設備、檢測極限值等均缺乏統一標準，導致同一份樣本在不同的實驗室的檢測結果，尤其在 EBV DNA 閾值設置上，存在較大差異，導致出現實驗結果無法重復，甚至結果互相矛盾的狀況。且依賴于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技術瓶頸，在這個意義上所謂的“定量”也只是相對的。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細微的條件下，其檢測的靈敏度、精確度都受到了限制。而檢測報告結果的準確性直接影響臨床疾病的診斷和治療效果的判斷，因此亟需研制更加敏感和精確的血漿EBV DNA定量方法和試劑，制定標準化的檢測和結果判定方法，以提高 EBV DNA 檢測臨床應用的可靠性。

數字PCR (digital PCR)是近年來新出現的技術，通過對樣本進行微小單元化處理，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，且數字PCR不依靠任何校準物或外標便可直接計數目標分子數，為絕對定量PCR技術。因此數字PCR特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

發明內容

本申請的目的是為克服現有技術的不足，提供一種有效提高EB病毒檢測靈敏度和準確度的基于微滴式數字PCR的EB病毒檢測試劑盒。