[發明專利]基于微滴式數字PCR的EB病毒檢測試劑盒

有效

• 申請號: 202010183957.X
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN111041131B
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 羅景燕;許少飛;李偉琴;賴炳權;張鈺瑩;曹紅豆;何繼謙
• 申請（專利權）人: 廣東永諾醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 廣州厚海專利商標代理事務所(普通合伙) 44662
• 代理人: 梁桂萍

1.一種基于微滴式數字PCR的EB病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

微滴式數字PCR用反應預混液，包括PCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、taq DNA聚合酶和UDG酶；

目的片段檢測混合液，包括目的片段的擴增引物和探針，目的片段的擴增引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，目的片段的探針的序列如SEQ ID No.3所示；

內標及內標檢測混合液，包括作為內標的外源重組質粒，以及所述內標的擴增引物和探針，內標的擴增引物的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，內標的探針的序列如SEQID No.6所示；

陽性對照預混液，包括作為陽性對照的含有所述目的片段的假病毒，以及稀釋用的人源血漿；

陰性對照預混液，包括人源血漿；

其中，所述陽性對照，包括第一陽性對照和第二陽性對照，所述第一陽性對照的拷貝數至少是第二陽性對照的拷貝數的100倍。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述目的片段的擴增引物的工作濃度為500～1000nM，所述目的片段的探針的工作濃度為200～500 nM；所述內標的擴增引物的工作濃度的為500～1000nM，所述內標的探針的工作濃度為200～500nM；所述目的片段檢測混合液中目的片段的擴增引物和探針的濃度為其工作濃度的5～10倍；所述內標檢測混合液中內標的擴增引物和探針的濃度為其工作濃度的5～10倍；所述目的片段檢測混合液和內標檢測混合液在試劑盒內預先混合。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述人源血漿采用正常人混合血漿。

4.如權利要求1～3任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的應用包括以下步驟：

1）獲取樣本的總DNA；

2）按照預設的反應數配置微滴式數字PCR的反應混合液的總體積；

3）按照預設的反應數制備各個反應體系；

4）將各個反應體系分別進行微液滴處理；

5）對各個經過微液滴處理的反應體系進行微滴式數字PCR擴增之后，根據擴增結果計算各個樣本的核酸濃度。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述樣本來源于人源血清和/或血漿；陽性對照和陰性對照需跟樣本一起提取，在提取步驟之前加入內標；所述獲取樣本的總DNA，通過核酸提取試劑盒進行抽提。

6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述預設的反應數的計算方法為待檢樣本數、陽性對照數以及陰性對照數的總和再加1；所述微滴式數字PCR的反應混合液包括微滴式數字PCR用反應預混液、目標片段檢測混合液、內標檢測混合液和無核酸酶水。

7.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述反應體系均需同時設置陽性對照和陰性對照；所述陽性對照來源于試劑盒內的陽性對照預混液；陰性對照來源于試劑盒內的陰性對照預混液；所述將各個反應體系進行微液滴處理時，每個反應體系的總微液滴數大于或等于50000，則確認微液滴生成有效。