[發明專利]一種脂肪源性干細胞的培養方法

在審

• 申請號: 202010183696.1
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN113403269A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 高山峨
• 申請（專利權）人: 上海泉眼生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海宏京知識產權代理事務所(普通合伙) 31297
• 代理人: 鄧文武

本發明涉及生物干細胞培養技術領域，特別是涉及一種脂肪源性干細胞的培養方法，包括：將脂肪塊與消化液震蕩消化，吸取上層脂肪細胞液加入培養基中密封離心，再加入培養基吹打細胞，即得脂肪源性干細胞懸液；滴加培養基使得培養瓶的頂部潤濕，將脂肪源性干細胞懸液接種至已潤濕的培養瓶的頂部，晃動培養瓶使得脂肪源性干細胞懸液與培養瓶的頂部接觸，將培養瓶翻轉180°，使得脂肪源性干細胞懸液鋪到培養瓶的底面，恒溫培養，即可。本發明解決了現有技術中組織貼壁法中由于脂肪油滴阻礙細胞貼壁從而導致細胞貼壁率低和細胞提取效率低的問題，利用培養瓶親油的特性，通過預先在頂部吸附脂肪油滴，提高細胞貼壁率和細胞提取效率。

技術領域

本發明涉及生物干細胞培養技術領域，特別是涉及一種脂肪源性干細胞的培養方法。

背景技術

脂肪源性干細胞(adiposetissue-derived stem cells，ADSCs)，是一類可以自我更新、繁殖的干細胞，具有一般干細胞的多向分化潛能和穩定的體外多代增殖能力。不僅能在不同誘導因子的作用下分化成為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞等，而且還能分泌大量的、多類型的細胞因子及促進血管生成因子和凋亡因子，并能通過旁分泌作用于成纖維細胞促進其分泌I型膠原、III型膠原和纖連蛋白，促進膠原合成，可發揮抗炎、抗氧化、抗衰老、損傷修復等作用。此外脂肪組織儲量豐富且獲取簡便，且無倫理爭議，是組織工程研究中理想的種子細胞來源之一。

目前脂肪源干細胞的提取方式多采用機械法、酶消化和組織貼壁培養法。酶消化法和機械法的操作過程較繁瑣；此外酶消化法消化時間長，消化后所得脂肪血管基質碎片，成分復雜。組織貼壁法操作步驟少，實驗處理時間短，且不加入外源膠原酶、細胞因子等，成本較低，但在操作過程中脂肪油滴阻礙細胞貼壁，很難保證組織塊全部貼壁，且換液時容易漂浮，細胞提取效率不高。此外平時使用的聚苯乙烯材料的無菌一次性培養瓶表面具有很強的親油特性，用上述組織貼壁法提取脂肪源性干細胞，不可避免的會使得培養瓶底部沾染上消化出來的脂肪油滴，而沾染脂肪油滴的部位細胞就不能貼壁生長，因此培養瓶底部的“有效面積”大大減少，長出的細胞也會減少很多。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種脂肪源性干細胞的培養方法，解決了現有技術中組織貼壁法中由于脂肪油滴阻礙細胞貼壁從而導致細胞貼壁率低和細胞提取效率低的問題。本發明利用培養瓶親油的特性，通過預先在頂部吸附脂肪油滴，從而避免培養瓶底面出現脂肪油滴，提高細胞貼壁率和細胞提取效率。

為實現上述目的及其他相關目的，

本發明提供一種脂肪源性干細胞的培養方法，包括如下步驟：

步驟一、將脂肪塊與消化液按照體積比為2：(0.8～1.2)混合，在30～40℃下震蕩消化10～90min，靜置，吸取上層脂肪細胞液加入培養基中，密封后離心去除上清液，再加入培養基吹打細胞，即得脂肪源性干細胞懸液待用；

步驟二、滴加培養基使得培養瓶的頂部潤濕，將脂肪源性干細胞懸液接種至已潤濕的培養瓶的頂部，晃動培養瓶使得脂肪源性干細胞懸液與培養瓶的頂部接觸，將培養瓶翻轉180°，使得脂肪源性干細胞懸液鋪到培養瓶的底面，在35～40℃下進行恒溫培養，即可。

脂肪塊與消化液混合后震蕩消化，再將上層脂肪細胞液移入培養基中離心，再通過吹打即可制成脂肪源性干細胞懸液。將脂肪源性干細胞懸液接種在預先潤濕的培養瓶的頂部，晃動培養瓶使得脂肪源性干細胞懸液與培養瓶的頂部充分接觸，此時利用培養瓶親油的特性，通過晃動的過程使得脂肪油滴吸附在培養瓶的頂部。通過180°旋轉使得脂肪油滴依舊吸附在培養瓶的頂部，脂肪源性干細胞懸液可以鋪到培養瓶的底面，從而避免培養瓶底面出現脂肪油滴，提高細胞貼壁率和細胞提取效率。

于本發明的一實施例中，所述步驟一中脂肪塊與消化液的體積比為2：1。

于本發明的一實施例中，所述步驟一中消化液含有濃度為0.1～5mg/ml的I型膠原酶。