[發明專利]optrA耐藥蛋白雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010180299.9
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN111273039A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 劉河冰;馬立才;楊柳
• 申請（專利權）人: 北京維德維康生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535
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本發明提供一種用于檢測細菌中optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及其檢測方法，包括包被有單克隆抗體5C6的酶標板、檢測抗體2F3?HRP、optrA蛋白。本發明選用5C6作為捕獲抗體，2F3?HRP作為檢測抗體研制了optrA雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，并對其進行了方法學系統評估，結果顯示試劑盒特異性好，靈敏度高，為optrA陽性耐藥菌的快速檢測提供了一種技術手段。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及方法，屬于免疫學分析技術領域。

背景技術

optrA基因由我國學者于2015年從1株臨床分離的糞腸球菌09E349中首次發現，并且已被證明還可以介導細菌對氟化和非氟化氯霉素的耐藥性。研究表明，optrA屬于ABC蛋白家族，是一種新發現的耐藥蛋白，既可介導腸球菌對惡唑烷酮類和利膽醇類抗生素的耐藥性，還可以介導金黃色葡萄球菌對氯霉素類的耐藥性。optrA被確定存在于中國的人源和動物源的腸球菌中，在中國，人源的主要分布于江西、天津、浙江；動物源的主要分布在河南、山東、上海、廣東、西藏。自optrA首次在中國報道后，世界范圍內多個國家開始檢出optrA陽性的腸球菌，并且在部分國家臨床和動物來源菌株（如波蘭、哥倫比亞）檢出的攜帶optrA基因的質粒與pE349有很高的相似性，這提示可能存在人畜之間的傳播。2016年，意大利也發現了攜帶optrA基因的腸球菌。由于腸球菌的感染已經成為疾病治療中的主要問題之一，因此耐藥基因optrA的出現和蔓延將有望成為臨床治療腸球菌感染的一個重要靶點。

本發明應用的酶聯免疫吸附法（ELISA）具有快速、靈敏、特異性好且操作簡便等特點，因此建立一種用于檢測optrA基因的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及方法，對其基因檢測和方法開發具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測快速的檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心酶聯免疫試劑盒及檢測方法。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種用于檢測細菌中optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，包括：包被有單克隆抗體5C6的酶標板、檢測抗體2F3-HRP、optrA蛋白標準品。

在一個實施方案中，所述檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，包括：

PCR擴增目的片段并克隆至表達載體pET28a，將成功構建的重組表達質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG誘導表達，經親和層析和分子篩層析高度純化后得到optrA重組蛋白；

上述重組optrA蛋白氨基酸序列為序列1；

在一個實施方案中，所述optrA單克隆抗體5C6，2F3為采用重組optrA蛋白免疫小鼠，經融合、克隆、篩選，得到的；

所述單克隆抗體5C6的重鏈可變區的氨基酸序列為序列2；

所述單克隆抗體5C6的輕鏈可變區的氨基酸序列為序列3；

所述單克隆抗體2F3的重鏈可變區的氨基酸序列為序列4；

所述單克隆抗體2F3的輕鏈可變區的氨基酸序列為序列5。

在一個實施方案中，所述檢測抗體2F3-HRP的制備方法包括如下步驟：

（1）稱取5 mg HRP溶于1 mL三蒸水中，逐滴緩慢加入0.20 mL新配的0.1 M NaIO₄溶液，4℃避光攪拌25 min，活化HRP，顏色由棕色變為綠色；上述溶液裝入透析袋中，用1 M，pH4.4的醋酸鈉緩沖液中4℃過夜透析，然后10000 r/min，4℃，離心10 min，去除沉淀；得到透析后的HRP；