[發明專利]optrA耐藥蛋白雙抗夾心ELISA檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010180299.9
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN111273039A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 劉河冰;馬立才;楊柳
• 申請（專利權）人: 北京維德維康生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535
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1.一種用于檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，包括：包被有單克隆抗體5C6的酶標板、檢測抗體2F3-HRP、optrA蛋白標準品。

2.根據權利要求1所述的檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于：

所述捕獲抗體5C6和檢測抗體2F3為采用optrA重組蛋白免疫小鼠，經融合、克隆、篩選，得到的。

3.根據權利要求1或2所述的檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于：

所述單克隆抗體5C6的重鏈可變區的氨基酸序列為序列2；

所述單克隆抗體5C6的輕鏈可變區的氨基酸序列為序列3；

所述單克隆抗體2F3的重鏈可變區的氨基酸序列為序列4；

所述單克隆抗體2F3的輕鏈可變區的氨基酸序列為序列5。

4.根據權利要求2所述的檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于：

PCR擴增目的片段并克隆至表達載體pET28a，將成功構建的重組表達質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG誘導表達，經親和層析和分子篩層析高度純化后得到optrA、重組蛋白。

5.根據權利要求4所述的檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于，重組optrA蛋白氨基酸序列為序列1。

6.根據權利要求1所述的檢測optrA耐藥蛋白的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體2F3-HRP制備步驟包括：

（1）稱取5 mg HRP溶于1 mL三蒸水中，逐滴緩慢加入0.20 mL新配的0.1 M NaIO₄溶液，4℃避光攪拌25 min，活化HRP，顏色由棕色變為綠色；上述溶液裝入透析袋中，用1 M，pH為4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜，10000 r/min，4℃，10 min，離心去除沉淀；得到透析后的HRP；

（2）將單克隆抗體5C6抗體用0.2 M，pH為9.5的碳酸緩沖液4℃透析過夜，得到透析后的抗體；

（3）將透析后的HRP加入0.16 M乙二醇（每mg酶加0.1 mL），4℃避光攪拌1 h，然后加入透析后的抗體；兩者混勻后用0.05 M，pH為9.5的碳酸緩沖液4℃透析過夜，得到HRP-抗體混合液；

（4）對0.15 M pH 7.4 PBS透析過夜；攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸氨，4℃避光攪拌3 h；4℃，10000 rpm離心15 min，棄上清；PBS溶解沉淀，得到經辣根過氧化物酶標記的檢測抗體2F3-HRP，使用酶標記物稀釋液1:30000倍稀釋后備用。

7.一種制備權利要求1-6中任一所述的試劑盒的方法，包括如下步驟：

1）包被有單克隆抗體5C6的酶標板的制備：將單克隆抗體5C6用碳酸鹽緩沖液稀釋成濃度為5 μg/mL的抗體包被液，每孔100 μL，4℃包被過夜后洗板；然后每孔加入100 μL封閉液，37℃、濕度30-40%封閉2 h，37℃、濕度30-40%恒溫干燥2 h；

2）檢測抗體稀釋液：0.01 M pH7.4的PBST溶液；

3）檢測抗體工作液的制備：檢測抗體2F3-HRP按照 1:30000比例稀釋后備用；

4）樣品稀釋液的制備：0.01 M pH 7.4的PBS溶液；

5）底物A液的制備：含0.08%過氧化脲、0.025%PEG-2000、3.58%十二水合磷酸氫二鈉、0.96%一水合檸檬酸水溶液，調pH值至7.4；

6）底物B液的制備：含1.03%一水合檸檬酸、0.04% TMB、0.0008%硫代硫酸鈉、0.1%光穩定劑292、3% DMF水溶液，調pH值至5.0。