[發明專利]一種宏基因組二代測序的建庫樣本的制備方法

在審

• 申請號: 202010176692.0
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111471676A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 梁志坤;李貽林;吳英松;李明;楊學習;周俊華
• 申請（專利權）人: 廣州市達瑞生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發明公開了一種宏基因組二代測序的建庫樣本的制備方法，包括以下步驟：采集樣本，并制備樣本溶液；裂解樣本溶液中的宿主細胞，并消化樣本溶液釋放出的DNA，通過酶法和機械法進行破壁，得到樣本1；對樣本溶液進行DNA酶消化，得到樣本2；將樣本1和樣本2合并，提取總核酸；總核酸分為兩部分：一部分去除rRNA，反轉錄為cDNA，與另一部分混合。利用本發明提出的針對二代測序的宏基因組建庫樣本的方法進行宏基因組測序，測序的檢測能同時檢測DNA和RNA病毒，以能保證不遺漏RNA病毒；檢測可對樣本中總核酸進行檢測，檢測的靈敏度高，對于樣本中所有微生物均能檢。

技術領域

本發明涉及宏基因組技術領域，更具體地，涉及一種宏基因組二代測序的建庫樣本的制備方法。

背景技術

目前，感染性疾病是當今世界上威脅人類健康的重點疾病。目前，全球感染性疾病的發病率有所上升，病原呈現多樣化和復雜化的發展趨勢，各種新發和再發的感染性疾病、不易發現的多重感染以及不明原因的發熱，都給人類健康帶來巨大的威脅，因此，臨床上對感染性疾病的診斷的真確性和實效性提出了更好的要求。

臨床上傳統的鑒定方法基于兩種策略：一種是給予細胞培養的方法，作為鑒定病原微生物的金標準，但其依賴于樣本，且對試驗和技術條件十分嚴格限制其廣泛應用；另一種是基于特異性引物/探針/抗體的方法，如抗原抗體反應，PCR反應，等特異性快速檢測系統，但其基于特異性的方法只能檢測已知的病原體，無法應對未知及人工改造的病原體，通量不夠且陽性率低等短處，導致其無法解決很多臨床問題。病原體的常規檢測方法存在陽性率低，周期長，對操作人員的技術水平要求比較高等局限。

近年來高速發展的NGS技術因其不依賴于已知的核酸序列，無需特殊設計探針，課直接懟未知病原微生物進行檢測，打破了傳統微生物檢測的局限性，在臨床微生物領域展現量廣闊的前景。

宏基因組學是以某一特定環境樣品中的病原體群體基因組為研究對象，以測序分析為研究手段，以病原體多樣性，種群結構，進化關系，功能活性，相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的的病原體研究方法，宏基因組可不依賴培養，無需對病原體進行假設，同時，一旦發現病原體的基因組序列，即可實現有關溯源，耐藥，毒力等多種分析，結果具有很高的實用價值，這些特點彌補了傳統檢測方式的不足。

但是，目前利用宏基因組技術檢測病原微生物檢測的靈敏度還需要進一步提高，以滿足臨床上的要求。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種宏基因組二代測序的建庫樣本的制備方法，使得DNA和RNA一起建庫上機，使得檢測結果更為準去和靈敏。

本發明的目的是提供一種宏基因組二代測序的建庫樣本的制備方法

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：

本發明要求保護一種宏基因二代測序的建庫樣本的制備方法，包括以下步驟：

采集樣本，并制備樣本溶液；

裂解樣本溶液中的宿主細胞，并消化樣本溶液釋放出的DNA，通過酶法和機械法進行破壁，得到樣本1；

對樣本溶液進行DNA酶消化，得到樣本2；

將樣本1和樣本2合并，提取總核酸；

總核酸分為兩部分：一部分去除rRNA，反轉錄為cDNA，與另一部分混合；

其中，裂解樣本溶液中的宿主細胞的方法為，樣本溶液與皂苷溶液混合，至皂苷的終質量濃度為0.22％～2.2％，孵育10～60min，再加入NaCl反應。

最優選地，皂苷的終質量濃度為2.2％，孵育30min。