[發明專利]畢赤酵母宿主蛋白殘留的檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202010176369.3
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111426843A
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 劉國良;唐爽;郭林峰;謝燦;馮艷;徐軍;李曉平;陳小鋒;李文佳
• 申請（專利權）人: 東莞市東陽光生物藥研發有限公司;廣東東陽光藥業有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

本發明提出一種宿主蛋白殘留的檢測試劑盒。該試劑盒包括：多克隆抗體以及任選的生物標記的多克隆抗體，所述多克隆抗體特異性識別所述宿主蛋白，其中，所述多克隆抗體是通過如下方式獲得的：利用抗原對第一待免疫動物進行主動免疫，以便獲得第一含有抗體的血清；利用所述第一含有抗體的血清對第二待免疫動物進行被動免疫，以便獲得第二含有抗體的血清；將含有第二抗體的血清進行純化處理，以便獲得第二抗體，所述多克隆抗體包括所述第二抗體。利用根據本發明實施例的試劑盒檢測生物藥產品中的宿主蛋白的殘留，靈敏度和準確度均顯著提高。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及畢赤酵母宿主蛋白殘留的檢測試劑盒以及檢測待測樣品中畢赤酵母宿主蛋白殘留的方法。

背景技術

市面上的重組蛋白酶系由工程菌重組表達，經純化得到重組蛋白酶。但所獲得的重組蛋白酶會有宿主蛋白殘留的風險，按照ICHQ6B的管理規定，宿主蛋白是生物藥產品的工藝相關雜質，需要建立適合的檢測方法進行嚴格控制。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。

為此，本發明提出一種宿主蛋白殘留的檢測試劑盒。根據本發明的實施例，所述試劑盒包括：多克隆抗體以及任選的生物標記的多克隆抗體，所述多克隆抗體特異性識別所述宿主蛋白，其中，所述多克隆抗體是通過如下方式獲得的：利用抗原對第一待免疫動物進行主動免疫，以便獲得第一含有抗體的血清；利用所述第一含有抗體的血清對第二待免疫動物進行被動免疫，以便獲得第二含有抗體的血清；將含有第二抗體的血清進行純化處理，以便獲得第二抗體，所述多克隆抗體包括所述第二抗體。根發明人發現，上述方法所獲得的多克隆抗體的覆蓋率，相比于現有技術，顯著提高。利用根據本發明實施例的試劑盒檢測生物藥產品中的宿主蛋白的殘留，靈敏度和準確度均顯著提高。

根據本發明的實施例，上述試劑盒還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，上述制備抗體的方法進一步包括將第一含有抗體的血清進行純化處理，以便獲得第一抗體；將第一抗體與所述第二抗體混合，以便獲得所述多克隆抗體。進而抗體的覆蓋率進一步提高。

根據本發明的實施例，所述抗原為細胞全蛋白HCPs。

根據本發明的具體實施例，所述抗原為發酵工程菌HCPs。

根據本發明的具體實施例，所述抗原為畢赤酵母HCPs。

根據本發明的具體實施例，所述第一待免疫動物和/或第二待免疫動物為新西蘭大白兔。

根據本發明的實施例，所述發酵工程菌HCPs是通過如下方式獲得的：將攜帶空載體的發酵工程菌進行發酵處理，以便使發酵工程菌的OD600至少達到400，優選地，不超過600，發酵液作為免疫原1(包括發酵上清和菌體)，將發酵液上清作為免疫原2，將發酵工程菌菌體作為免疫原3；將發酵液進行親和層析處理，層析處理液作為免疫原4。發明人在抗體制備過程中，模擬工程菌發酵產品的生產工藝，采用攜帶空載載體的發酵工程菌進行發酵，以獲得免疫原。發明人發現，將發酵過程后上述四種免疫原分別作為免疫原免疫個體，再把獲得的抗體混合，相比上述任意一種單一免疫原作為免疫原免疫個體，獲得的抗體，其覆蓋率進一步顯著提高。

根據本發明的具體實施例，所述發酵液進行親和層析處理是通過如下方式進行的：采用博格隆的EzFast protein A Diamond親和層析柱，偶聯約10～30mg的抗含pPIC9K空白載體的Pichia Pastoris細胞全蛋白HCPs的多克隆抗體，然后再上樣1～1.5mg的含pPIC9K空白載體的Pichia Pastoris細胞全蛋白HCPs，收集其穿透液，即為所需的免疫原4。