[發明專利]一種藤茶內生菌產氨基酸的工藝

在審

• 申請號: 202010175932.5
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111334432A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 陳仕學;王云洋;姚元勇;何來斌;王光明;馬永慧;袁利軍;周仙
• 申請（專利權）人: 銅仁學院
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12P13/04
• 代理公司: 北京艾皮專利代理有限公司 11777
• 代理人: 馮鐵惠

1.一種藤茶內生菌產氨基酸的工藝，其特征在于：包括以下步驟；

（1）原料的采摘：利用剪刀采摘藤茶枝頭嫩葉，避光保存；

（2）原料的處理：將步驟（1）中采集的藤茶嫩葉用自來水沖洗5min，將嫩葉放入燒杯中，蒸餾水浸泡30min，10min更換一次蒸餾水，更換3次；

（3）接種工具的處理：將接種工具（鑷子，手術刀，工具架）利用報紙包扎好放入高壓滅菌鍋中，121℃條件下滅菌30min；

（4）內生菌培養基的制作：稱取 200g馬鈴薯并去皮，切成小薄片，加水 1000mL,煮沸20min 后，用紗布過濾，濾液中加人 20g葡萄糖、20g 瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL制作培養基，將培養基置于高壓滅菌鍋，121℃高壓滅菌30min，冷卻備用；

（5）接種工具與培養基的后處理：將已滅菌后的接種工具與培養基，轉移至超潔凈工作臺進行紫外滅菌并循環接種臺中的空氣；

（6）接種前葉子的處理：將步驟（2）處理的藤茶葉子用步驟（3）中處理過的鑷子夾取放入75%（乙醇:水=75:25,V/V,）的乙醇溶液體外消毒3次，每次5s →轉入無菌水中清洗2次，每次2min→藤茶葉轉入84消毒液，清洗3次，每次2min→藤茶葉轉入無菌水中清洗3次，每次2min→藤茶葉轉移到無菌紙上，吸干水份備用；

（7）內生菌的接種：將步驟（6）處理后的藤茶葉轉移到干凈的無菌紙上，用（3）中處理的鑷子壓住葉子，用手術刀將葉子邊緣切去2mm，再將葉子切成4mm×4mm正方形形狀，使用鑷子將葉子正面向上，背面接觸 （4）中配制、處理的培養基中，再利用鑷子輕輕壓緊，使背面全部接觸培養基，然后再蓋上培養皿，將培養皿轉移至恒溫培養箱中，以恒溫箱中恒溫30℃培養6天；

（8）固體發酵培養基的制作：按棉籽殼75%，麩皮22%，CaCO₃1%，MgSO₄1%，尿素1%比例配制培養基，每袋總量為250g。先將棉籽殼用水浸泡24h，將其中的水擠出，手指縫中無水流出即停止，再將麩皮、CaCO₃、MgSO₄、尿素按照比例進行混合均勻，裝入出菇袋中，壓緊，用高壓滅菌鍋以121℃，滅菌30min，備用；

（9）內生菌固體發酵培養：將步驟（7）中培養后的內生菌進行顏色辨別挑取，至步驟（4）中的培養基中培養4天，將培養出的菌種挑取到步驟（8）固體發酵袋中，然后將固體發酵培養基轉移到恒溫箱中以30℃，暗培養6天，待內生菌將長滿整個發酵袋，用于氨基酸檢測。

2.根據權利要求1所述的一種藤茶內生菌產氨基酸的工藝，其特征在于：步驟（2）中選擇藤茶中黃色的內生菌進行發酵培養。

3.根據權利要求1所述的一種藤茶內生菌產氨基酸的工藝，其特征在于：還包括內生菌固體發酵培養氨基酸的影響因素選擇：從藤茶部位、菌種選擇、培養溫度以及培養時間進行選擇：利用精氨酸標準品制作標準曲線，將提取后的氨基酸通過紫外-可見分光度計，在570nm測量出提取液中氨基酸的吸光度值，將吸光度值帶入回歸方程，計算氨基酸提取率，根據提取率高低，選擇出產生氨基酸的優化條件為：藤茶葉片用于培養內生菌、黃色菌種、培養溫度為30℃，培養時間為6天。

4.根據權利要求1所述的一種藤茶內生菌產氨基酸的工藝，其特征在于：發酵產生氨基酸利用的是梵凈山藤茶中的內生菌作為發酵菌種源。

5.根據權利要求1所述的一種藤茶內生菌產氨基酸的工藝，其特征在于：步驟（4）中發酵培養時間需要6天左右。根據氨基酸提取率與時間關系圖可以得出，在6天后，氨基酸的含量趨于平緩，為保證得到更多的氨基酸以及節約時間，取6天為最佳培養時間。