[發(fā)明專利]一種可同時(shí)檢測多種基因型戊型病毒肝炎病毒的方法

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• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號(hào): CN111235315A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李智
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州智享眾創(chuàng)孵化管理有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 李寶碩

本發(fā)明公開了一種可同時(shí)檢測多種基因型戊型肝炎病毒的方法，該方法針對(duì)1型基因型戊型肝炎病毒、2型基因型戊型肝炎病毒、3型基因型戊型肝炎病毒、4型基因型戊型肝炎病毒的基因序列，進(jìn)行基因序列的綜合比對(duì)，設(shè)計(jì)引物和探針；各組探針針對(duì)不同型的病毒設(shè)計(jì)，可以針對(duì)HEV type 1，HEV type 3或4，HEV type 1,2,3,4進(jìn)行檢測，達(dá)到不同的需求皆能滿足地搭配。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可同時(shí)檢測多種基因型戊型病毒肝炎病毒的方法。

背景技術(shù)：

戊型肝炎病毒(HEV)是一個(gè)全世界嚴(yán)重的病毒性傳染疾病，每年全世界預(yù)估有2千萬人受戊型肝炎病毒感染，導(dǎo)致約3.3百萬人會(huì)出現(xiàn)有癥狀的戊型病毒肝炎，經(jīng)過WHO統(tǒng)計(jì)，2015年HEV導(dǎo)致44000人死忙，約占3.3％病毒肝炎的死亡率。這個(gè)疾病主要是以糞口途徑傳染，主要常見在東亞和南亞。

HEV目前已知至少有四個(gè)不同的基因型，第一、二型只感染人類，第三、四型在豬、鹿有潛伏病毒存在，偶爾會(huì)傳染給人。病毒是經(jīng)由糞便傳染人，例如喝下污染的飲用水，從小腸的途徑感染。

目前臨床上HEV確診主要是檢測病患血液中是否已經(jīng)產(chǎn)生了HEV的IgM抗體，而且在目前的方法中都是針對(duì)HEV type I病毒，對(duì)于HEV type 3病毒以及HEV type 4病毒的檢測方法很少，這樣，在防疫上會(huì)出現(xiàn)缺失，對(duì)人體健康有很大的威脅。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可同時(shí)檢測多種基因型戊型病毒肝炎病毒的方法，該方法操作簡單，可同時(shí)檢測4種基因型戊型肝炎病毒，大大提高的防疫的安全性，減少感染來源。

為更好的解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種可同時(shí)檢測多種基因型戊型肝炎病毒的方法，針對(duì)1型基因型戊型肝炎病毒、2型基因型戊型肝炎病毒、3型基因型戊型肝炎病毒、4型基因型戊型肝炎病毒的基因序列，進(jìn)行基因序列的綜合比對(duì)，設(shè)計(jì)引物和探針；

所述引物的序列為：

HEV-5 CATCCAACCAACCCCTTCGC，

HEV-3 TGGGMYTGGTCRCGCCAA，

所述探針的序列為：

HEV-1P GACCTCGTGTTCGCCAACCC，

HEV-3/4P GAGCTCGCCCTCGRCAGCCR，

HEV-P GASCTCGYSYTCGVCARCCV；

其中，M代表簡并堿基AC；

Y代表簡并堿基TC；

R代表簡并堿基AG；

S代表簡并堿基GC；

V代表簡并堿基ACG；

檢測的方法具體包括以下步驟：

(1)以倉鼠卵巢細(xì)胞的懸浮液作為待測樣品，以TRIzol試劑提取RNA，RNA洗脫在50μl TE緩沖液中，在-80℃下儲(chǔ)存待用；

(2)取5μl上述提取的RNA、10μlRT-PCR酶混合物，50pmol引物、50pmol探針，加入到PCR管中，混合均勻后加入不含RNase的純水補(bǔ)充至40μl；

(3)首先進(jìn)行第一階段的反應(yīng)，即在50℃下反應(yīng)5min，然后進(jìn)行第二階段的反應(yīng)，即在95℃下反應(yīng)20s，最后進(jìn)行第三階段的反應(yīng)，即在95℃下反應(yīng)15s，在62℃下反應(yīng)30s，如此將第三階段的反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后以4℃停止反應(yīng)；檢測過程中通過實(shí)時(shí)定量聚合酶連鎖反應(yīng)機(jī)器或瓊脂電泳法確認(rèn)是否有HEV病毒存在的信號(hào)。