[發明專利]一種可同時檢測多種基因型戊型病毒肝炎病毒的方法

在審

• 申請號: 202010175842.6
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111235315A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 李智
• 申請（專利權）人: 蘇州智享眾創孵化管理有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 李寶碩

1.一種可同時檢測多種基因型戊型肝炎病毒的方法，其特征在于，針對1型基因型戊型肝炎病毒、2型基因型戊型肝炎病毒、3型基因型戊型肝炎病毒、4型基因型戊型肝炎病毒的基因序列，進行基因序列的綜合比對，設計引物和探針；

所述引物的序列為：

HEV-5 CATCCAACCAACCCCTTCGC，

HEV-3 TGGGMYTGGTCRCGCCAA，

所述探針的序列為：

HEV-1P GACCTCGTGTTCGCCAACCC，

HEV-3/4P GAGCTCGCCCTCGRCAGCCR，

HEV-P GASCTCGYSYTCGVCARCCV；

其中，M代表簡并堿基AC；

Y代表簡并堿基TC；

R代表簡并堿基AG；

S代表簡并堿基GC；

V代表簡并堿基ACG；

檢測的方法具體包括以下步驟：

(1)以倉鼠卵巢細胞的懸浮液作為待測樣品，以TRIzol試劑提取RNA，RNA洗脫在50μlTE緩沖液中，在-80℃下儲存待用；

(2)取5μl上述提取的RNA、10μlRT-PCR酶混合物，50pmol引物、50pmol探針，加入到PCR管中，混合均勻后加入不含RNase的純水補充至40μl；

(3)首先進行第一階段的反應，即在50℃下反應5min，然后進行第二階段的反應，即在95℃下反應20s，最后進行第三階段的反應，即在95℃下反應15s，在62℃下反應30s，如此將第三階段的反應進行40個循環，最后以4℃停止反應；檢測過程中通過實時定量聚合酶連鎖反應機器或瓊脂電泳法確認是否有HEV病毒存在的信號。

2.根據權利要求1所述的一種可同時檢測多種基因型戊型肝炎病毒的方法，其特征在于：所述引物和序列設計的具體步驟為：

1)收集HEV不同型的基因序列，經過多基因比對方法，找出不同型的基因相似度高的區域，以此區域進行引物和探針設計；

2)將所設計的引物和探針，回溯到相似區域內，避開區域內相似度低的部分，挑選PCR反應中片段小于200bp，引物和探針的解離溫度大于60℃以上的片段；并進行引物共享堿基的改造，設計出不同的探針組；

3)將所設計的引物和探針組，在基因庫內比對，挑選出對HEV檢測專一性高的引物和探針組。