[發明專利]一種石蠟包埋三維懸浮細胞團的免疫熒光染色方法

在審

• 申請號: 202010174436.8
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111207987A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 宋益哲;曹易照;歐鎮生;粱德燦;李景秋;劉靖;凌伊;王慧;陳小鋒;李文佳
• 申請（專利權）人: 東莞市東陽光生物藥研發有限公司;廣東東陽光藥業有限公司
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N33/533
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 郭奧博;王瑩

本發明涉及一種石蠟包埋三維懸浮細胞團的免疫熒光染色方法，該方法包括如下步驟：對三維懸浮細胞團進行預處理后，浸入石蠟液中包埋切片，進行抗原修復，再進行免疫熒光染色。本發明提供的方法細胞團內部細胞染色充分，結果準確，可以觀察懸浮細胞團整體的蛋白表達和分布情況，且僅需要普通的熒光顯微鏡即可進行樣本觀察。

技術領域

本發明涉及細胞生物學及相關檢測領域，具體涉及一種石蠟包埋三維懸浮細胞團的免疫熒光染色方法。

背景技術

免疫熒光技術(Immunofluorescence technique)是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，該方法將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。

目前，有關3D懸浮細胞團(球)的免疫熒光染色方法主要包括：(1)離心法；缺陷是離心會造成部分細胞團損失、細胞受到損害、散掉變形，細胞團內部細胞染色不充分。(2)借助染色裝置染色法；缺陷是去除殘留液體不完全或細胞團容易變干，一個裝置只能做一組樣品，浪費試劑和抗體。并且，以上方法均需要借助價格昂貴的激光共聚焦顯微鏡觀察染色結果，細胞團內部細胞染色效果無法判斷。

如果直接使用經典石蠟包埋技術進行3D懸浮細胞團包埋后的免疫熒光染色，則會出現染色效果差、背景很深或染不上色、細胞團切片容易從玻片上脫落等問題。

發明內容

本發明的目的在于針對現有的3D懸浮細胞團(球)免疫熒光染色技術的缺陷，提供了一種石蠟包埋3D懸浮細胞團的免疫熒光染色方法。本發明通過改進石蠟包埋前樣品的預處理方法、石蠟切片后樣品的抗原修復方法等，最終獲得了可以成功進行石蠟包埋3D懸浮細胞團免疫熒光染色的技術方案。

具體而言，本發明提供一種石蠟包埋三維懸浮細胞團的免疫熒光染色方法，該方法包括如下步驟：對三維懸浮細胞團進行預處理后，浸入石蠟液中包埋切片，進行抗原修復，再進行免疫熒光染色。

本發明所述細胞團可以是從動物體內取出的或人工培養的懸浮細胞團。

作為本發明的一種具體實施方式，所述細胞團為人胚胎干細胞細胞團，或是由人胚胎干細胞分化所得細胞的細胞團。

本發明所述預處理包括依次進行的：固定、脫水以及透明。

作為本發明的一種優選實施方式，所述固定采用3～5％甲醛溶液，在室溫固定0.5～1.5h。

作為本發明的一種優選實施方式，所述脫水依次采用濃度為65～75％、85～95％、100％的乙醇逐級進行。每次孵育時間4～6min。

作為本發明的一種優選實施方式，所述透明包括：將脫水后的細胞團在二甲苯中進行至少一次孵育，優選為2～4次，每次孵育時間4～6min。透明完成后，需晾干細胞團。

本發明將預處理后的細胞團浸入石蠟液中包埋。作為本發明的一種優選實施方式，將細胞團浸入溫度57～60℃的石蠟液，使其均勻分散沉入石蠟液的底部；浸蠟的時間優選為8～12min。

本發明所述切片的厚度優選為3～20μm。

本發明提供的方法在切片后，優選將載有細胞團的玻片烘干，然后脫蠟復水。

所述烘干的目的是去除切片中的水分，讓切片更加粘牢在玻片上。作為本發明的一種優選實施方式，所述烘干是將切好的片子置于40～45℃的烘箱中烘干。所述烘干時間優選為8～16小時。

所述脫蠟復水的目的是便于染色，如果脫蠟不徹底，會使切片不易著色。作為本發明的一種優選實施方式，所述脫蠟包括：在二甲苯中浸泡至少一次，每次4～6min。作為本發明的一種優選方案，所述復水依次采用濃度為100％、85～95％、65～75％的乙醇逐級進行，每次2～4min。