[發(fā)明專利]一種單一轉氨酶催化級聯(lián)反應不對稱合成L-草銨膦的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010174352.4
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111139271A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設計）人: 薛亞平;程峰;周仕芃;鄭裕國;金利群;徐建妙
• 申請（專利權）人: 浙江工業(yè)大學
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發(fā)明公開了一種單一轉氨酶催化級聯(lián)反應不對稱合成L?草銨膦的方法，該方法包括：以4?(甲基羥基磷酰基)?2?羰基?丁酸或其鹽為底物，在氨基供體存在的反應體系中，利用離體的轉氨酶或體外表達轉氨酶的細胞催化底物，發(fā)生轉氨反應，得到L?草銨膦；所述氨基供體為L?谷氨酸和L?天冬氨酸；反應體系中僅添加一種轉氨酶，且該轉氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本發(fā)明方法采用的轉氨酶ATA117?rd11催化級聯(lián)反應生產(chǎn)L?草銨膦工藝既解決了現(xiàn)在使用單一轉氨酶工藝中氨基供體用量過高的問題，又解決了現(xiàn)有兩種轉氨酶工藝中生物催化劑成本偏高、發(fā)酵工序繁瑣以及反應時間偏長的技術難題。

技術領域

本發(fā)明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種單一轉氨酶催化級聯(lián)反應不對稱合成L-草銨膦的方法。

背景技術

草銨膦，也稱草丁膦，英文名為Phsophinothricin(簡稱PPT)，化學名為2-氨基-4-[羥基(甲基)膦酰基]-丁酸，是一種高效、廣譜、低毒的非選擇性除草劑，是目前轉基因抗性作物理想的除草劑，應用前景非常廣闊。草銨膦具有兩種對映異構體，但只有L-構型具有植物毒性，且在土壤中易分解，對人類和動物的毒性小，對環(huán)境的破壞力小。目前，市場上銷售的草銨膦一般都是外消旋混合物。如果草銨膦產(chǎn)品能以L-構型的光學純異構體形式使用，可使草銨膦的使用量降低50％，這對于提高原子經(jīng)濟性、降低成本、減輕環(huán)境壓力都具有十分重要的意義。

生成L-草銨膦的方法有化學合成法、發(fā)酵法、生物合成法。其中，生物合成法中涉及到的酶類主要有：蛋白酶、脫乙酰基酶、轉氨酶、酰胺酶、酯水解酶和腈水合酶。在諸多草銨膦的酶法合成路線中，酮酸中間體的酮羰基是潛手性官能團，能夠通過酶法合成途徑構建手性中心，酮酸路線也因原料價廉易得且可以避免使用劇毒氰化物，而成為適宜L-草銨膦工業(yè)化開發(fā)生產(chǎn)的路線。

轉氨酶(Amine Transaminase,ATA,EC2.6.1.X)屬于轉移酶類，是催化1個氨基供體(氨基酸或簡單的胺)上的氨基轉移到前手性的受體酮，得到手性胺和副產(chǎn)物酮或者α-酮酸的一類酶，反應過程需要磷酸吡哆醛(Pyrid oxal phosphate,PLP)的參與，其催化的反應是可逆的。根據(jù)氨基被轉移到不同位置的氨基受體上，轉氨酶又可以被分為α-轉氨酶和ω-轉氨酶(EC2.6.1.1)ω-轉氨酶反應過程可分為兩步，第一步反應是在ω-轉氨酶的作用下將氨基供體上的氨基轉移到PLP的羰基上，從而形成5-磷酸吡哆胺(PMP)和與氨基供體對應的酮；第二步反應同樣在ω-轉氨酶的作用下將PMP上的氨基轉移到氨基受體上，PMP又轉變?yōu)镻LP實現(xiàn)循環(huán)。

Schulz A等利用從E.coli K-12中分離到的轉氨酶，以2-羰基-4-(羥基甲基膦酰胺)丁酸為底物，L-谷氨酸作為氨基供體，利用轉氨作用生產(chǎn)L-草銨膦(Stereospecificproduction of the herbicide phosphinothricin(gluf osinate)by transamination:isolation and characterization of a phosphinot hricin-specific transaminasefrom Escherichia coli[J].Applied and Envir onmental Microbiology,1990,56(1):1-6)，產(chǎn)物最高濃度可達76.1g/L。轉氨酶經(jīng)固定化后安裝至生物反應器，反應器的最高產(chǎn)物生成速率為50g/(L.h)，草銨膦e.e.值超過99.9％。但這個工藝有兩大缺陷，其一是原料PPO不能完全轉化為L-PPT，轉化率最高只有90％；其二是要使可逆反應向生成L-PPT的方向進行，需要4倍當量以上的L-谷氨酸作為氨基供體，過量的谷氨酸給分離帶來了很大的麻煩，問題的關鍵在于以L-谷氨酸作為氨基供體時酶促轉氨反應是一個可逆反應。