[發明專利]一種基于PCR-RFLP快速鑒定草地貪夜蛾的方法

有效

• 申請號: 202010173585.2
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111269968B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 黃立華;江健釗;李梓釗;馮興暴
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/683
• 分類號: C12Q1/683
• 代理公司: 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 宋紅賓

本發明公開了一種基于PCR?RFLP快速鑒定草地貪夜蛾的方法。本發明通過分析草地貪夜蛾與其它近緣種在COI序列上的差異，以及草地貪夜蛾兩種生物型在Tpi序列上的差異，獲得了草地貪夜蛾及其生物型特異性的SNP位點，并針對其中的SNP位點設計了相應的限制性內切酶。采用基于聚合酶鏈式反應的限制性酶切圖譜多樣性分析技術(PCR?RFLP)實現了草地貪夜蛾及其生物型的快速鑒定。為基層農業技術人員以及相關農業科研人員開展草地貪夜蛾鑒定、預測預報和防治提供了一種新的便利方法。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種基于PCR-RFLP快速鑒定草地貪夜蛾的方法。

背景技術

草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)是一種原產于南美洲的爆食性農業害蟲，被列為我國重要的檢驗檢疫對象。它具有很強的遷飛能力，擴散能力非常強。2019年1月首次在我國云南被發現。不到一年的時間，該害蟲已經擴散至29個省份。目前，草地貪夜蛾在我國主要為害玉米，可造成作物減產15-73％。此外，已經發現該害蟲還能夠為害小麥、大豆、甘蔗等。在美國和非洲，草地貪夜蛾還能夠嚴重為害水稻。因此，該害蟲對我國水稻生產也帶來了潛在的嚴重威脅。

草地貪夜蛾目前主要在我國玉米上嚴重為害，與玉米上常發的其它鱗翅目害蟲，如斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、黏蟲等高度相似，給基層農業技術人員的測報和防治工作帶來了困難。此外，草地貪夜蛾有兩種不同的生物型，玉米型(Corn strain,C型)和水稻型(Ricestrain,R型)。前者主要為害玉米、棉花、高粱等作物，后者主要為害水稻、苜蓿、狗牙根草等。兩種生物型幾乎不能從外表上加以區分，但它們在生理、生態、行為等方面卻出現了很大的分化。例如，玉米型對二嗪農、西維因等殺蟲劑具有更高的抗藥性，而水稻型則對蟲螨威具有更高的抗藥性。此外，玉米型對轉Bt基因的棉花具有更高的耐受性。這就更加需要我們準確地鑒定草地貪夜蛾的生物型，并針對性地開展測報和防治工作。

以往對近緣種害蟲的鑒定一般都采用DNA barcoding(條形碼)方法。即克隆線粒體細胞色素氧化酶(COI)，然后測序，并構建系統進化樹進行聚類分析，最后加以鑒定。但這種方法依賴于大量的測序，不僅費時，也不經濟。此外，這種方法不能用于草地貪夜蛾生物型的鑒定。COI是一種線粒體基因marker(分子標記)，屬于母系遺傳。因此，這種遺傳標記無法對兩種生物型雜交的后代進行準確的鑒定。為此，目前主要采用核基因——磷酸丙糖異構酶(Tpi)進行生物型的鑒定。Nagoshi R.N.(2010)開發出了TPi上的10個SNP，根據這個10個SNP來區分水稻型和玉米型草地貪夜蛾。這個方法后來被廣泛采用。然而，這種方法也高度依賴于DNA測序，同樣費時、不經濟。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題為：如何快速的鑒定草地貪夜蛾及其近緣種。

本發明所要解決的第二個技術問題為：如何快速的鑒定草地貪夜蛾兩種生物型。

本發明的技術方案為：一種基于PCR-RFLP快速區分草地貪夜蛾及其近緣的方法，包括如下步驟：

(1)提取待鑒定材料的基因組DNA；

(2)以P1和P2為引物，步驟(1)得到的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到大小為697bp的COI基因片段；P1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，P2的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

(3)對步驟(2)得到的COI基因片段進行兩輪酶切：

1)第一輪，采用Tail和AlWN I對步驟(2)得到的COI基因片段進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，并對電泳結果進行拍照、分析：同時具有347bp、263bp和87bp條帶的為草地貪夜蛾和斜紋夜蛾，350bp條帶的為甜菜夜蛾，697bp條帶的為黏蟲；