[發明專利]一種基于PCR-RFLP快速鑒定草地貪夜蛾的方法有效
| 申請號： | 202010173585.2 | 申請日： | 2020-03-13 |
| 公開（公告）號： | CN111269968B | 公開（公告）日： | 2023-03-21 |
| 發明（設計）人： | 黃立華;江健釗;李梓釗;馮興暴 | 申請（專利權）人： | 華南師范大學 |
| 主分類號： | C12Q1/683 | 分類號： | C12Q1/683 |
| 代理公司： | 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241 | 代理人： | 宋紅賓 |
| 地址： | 510631 廣東省廣州*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 基于 pcr rflp 快速 鑒定 草地 夜蛾 方法 | ||
1.一種基于PCR-RFLP快速區分草地貪夜蛾及其近緣的方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）提取待鑒定材料的基因組DNA；
（2）以P1和P2為引物，步驟（1）得到的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到大小為697bp的COI基因片段；P1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，P2的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；
（3）對步驟（2）得到的COI基因片段進行兩輪酶切：
1）第一輪，采用Tail和AlWN I對步驟（2）得到的COI基因片段進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，并對電泳結果進行拍照、分析：同時具有347bp、263bp和87bp片段的為草地貪夜蛾和斜紋夜蛾，350bp的為甜菜夜蛾，697bp的為黏蟲；
2）第二輪，采用BstY I對步驟（2）得到的COI基因片段進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳，并對電泳結果進行拍照、分析：同時具有587bp和110bp片段的為草地貪夜蛾，同時具有300bp和110bp片段的為黏蟲，697bp的為斜紋夜蛾；
步驟（2）中，PCR擴增程序參數設置如下：95℃，5min；隨后進行35個循環擴增95℃，30s，54℃，30s，72℃，40s；最后72℃補充延伸10min；步驟（3）中，采用Tail和AlWN I對步驟（2）得到的COI基因片段進行雙酶切的方法為：先加入AlWN I，37℃反應1小時；然后加入Tail，65℃反應1小時。
2.一種基于PCR-RFLP快速區分草地貪夜蛾生物型的方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）提取待鑒定材料的基因組DNA；
（2）以P3和P4為引物，步驟（1）得到的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到大小為638bp的Tpi基因片段；P3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，P4的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；
（3）對步驟（2）得到的Tpi基因片段進行Ban I酶切，瓊脂糖凝膠電泳，并對電泳結果進行拍照、分析：具有638bp條帶的為水稻型草地貪夜蛾，同時具有370bp和268bp條帶的為玉米型草地貪夜蛾；
步驟（2）中，PCR擴增程序參數設置如下：95℃，5min；隨后進行35個循環擴增95℃，30s，54℃，30s，72℃，40s；最后72℃補充延伸10min，步驟（3）中，采用BanI對步驟（2）得到的Tpi基因片段進行酶切的條件為60℃，1小時。
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