[發明專利]一種耦合產戊二胺和丁二酸的重組大腸桿菌的構建及其應用

在審

• 申請號: 202010173153.1
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111411119A
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 陳可泉;馮嬌;王昕;許晟
• 申請（專利權）人: 南京凱諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/60;C12P7/46;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

本發明公開了一種耦合產戊二胺和丁二酸的重組大腸桿菌的構建及其應用。本發明將經過突變改造后pH耐受性有所改善的賴氨酸脫羧酶EcCadA?M3連接到表達載體pCDFDuet?1上，并導入一株高產丁二酸生產菌株E.coli AFP111，得到了能夠耦合生產戊二胺和丁二酸的重組菌株E.coli SC01。該細胞耦合生產戊二胺和丁二酸有效的解決這二者獨自合成存在的pH中和劑的問題，是一種能夠固定二氧化碳、減少溫室氣體排放及碳損失的綠色合成戊二胺和丁二酸途徑。

技術領域

本發明屬于戊二胺和丁二酸制備領域，具體涉及一種耦合生產戊二胺和丁二酸的重組大腸桿菌的構建及其應用。

背景技術

1,5-戊二胺（1,5-pentanediamine ），俗名1,5-二氨基戊烷，有類似氨氣的惡臭的氣味，簡稱尸胺。該物質易燃，高毒，具強刺激性。吸入后可因喉、支氣管的痙攣、炎癥和水腫，化學性肺炎或肺水腫而致死。中毒表現有咳嗽、喘息、喉炎、氣短、頭痛、惡心和嘔吐，嚴重時將死亡。

在細胞內,戊二胺是賴氨酸合成途徑的延伸反應，是賴氨酸在賴氨酸脫羧酶的作用下脫羧產生的，作為一種肉毒胺存在于腐敗物中，與鳥氨酸的脫羧產物腐胺一樣都是生物尸體腐敗產生的氣味中的一種成分。這種二胺不僅與腐敗作用有關，生物活體在生命代謝中也會產生少量的戊二胺，是生物體內廣泛存在的具有生物活性的含氮堿。戊二胺在農業、醫學和工業上均有廣泛的應用。在農業上，外源施加戊二胺可以改善坐果和促進果實發育，提高果實的產量；在醫學上，它可以作為一種有效治療痢疾的藥物；在工業上，戊二胺與二元酸進行聚合反應可合成優質的高分子材料。目前化學法合成1,5-戊二胺主要是以戊二腈為原料，在催化劑作用下首先轉為5-氨基戊腈，進而轉化為戊二胺，反應通常在高壓下進行。通過對催化劑的選擇和改性，戊二腈的轉化率可達到100 %，1,5-戊二胺選擇率達到66.8 %。化學法產量較高，但其反應條件劇烈，對設備要求較高，環境污染較大，且最終反應產物中有一定量的副產物六氫吡啶，并不適合大規模推廣。

丁二酸又稱玻用酸（Succinicacid, succinate），是種常見的天然有機酸。自1546

年首次從玻目中分離出來以后，丁二酸己經在農業、食品、醫藥等領域廣泛應用。

丁二酸是一種重要的化學品，可以用于表面活性劑、清潔劑、溶劑等領域，在食品行業中可以用作pH改良劑、風味物質或抗菌劑，也可以用作動物飼料添加劑及植物助長劑等。丁二酸在工業上也是種重要的四碳化合物，可以轉化為很多重要的化學品，如脂肪酸、1,4－丁二醇、四氫映喃、y-丁內醋等；還可以作為單體用來合成生物可降解材料PBS（聚丁酸玻舊酸）和聚氨醋目前己有超過250種以苯為原料的化工產品可以通過丁二酸轉化獲得，因此丁二酸的市場需求不斷增加。目前市場上銷售的丁二酸都是以液化石油氣或石油為原料化學法生產的。由于化學法生產丁二酸的成本過高，丁二酸銷量和產量并不高，應用領域收到很大限制。

盡管戊二胺及丁二酸可以通過生物法高效合成，但是在各自的生產和純化過程中大量的酸堿溶液被用于進行pH的中和，從而產生大量的廢棄鹽，使得后續的工藝過程變得復雜化。通過耦合戊二胺及丁二酸的合成過程則可以有效的解決由pH中和劑引起的問題，因為共生產體系的pH可以由堿性產物戊二胺和酸性產物丁二酸自身調節。此外，前期研究中Li等人以乙醇為溶劑通過醇析法結晶獲得己二胺十二烷二酸鹽的并用于合成PA6.12。因此，利用耦合生產pH調節策略，發酵液中的產物戊二胺和丁二酸可能可以直接成鹽并通過醇析法直接從發酵液中分離結晶獲得戊二胺丁二酸鹽，PA5.4的聚合工藝可能會大大簡化。在厭氧發酵生產丁二酸時，需要CO₂作為底物參與到丁二酸代謝合成途徑中。相反，CO₂會作為副產物在賴氨酸脫羧酶催化L-lys脫羧生成戊二胺的過程中釋放。因此，耦合戊二胺及丁二酸生產過程的另一個優點就是開發了一種可以固定二氧化碳、減少溫室氣體排放及碳損失的綠色合成途徑。