[發明專利]一種耦合產戊二胺和丁二酸的重組大腸桿菌的構建及其應用

在審

• 申請號: 202010173153.1
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111411119A
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 陳可泉;馮嬌;王昕;許晟
• 申請（專利權）人: 南京凱諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/60;C12P7/46;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

1.一種耦合產戊二胺和丁二酸的重組大腸桿菌的構建，其特征在于，將賴氨酸脫羧酶EcCadA-M3構建到高產丁二酸生產菌株E.coliAFP111中，所述賴氨酸脫羧酶EcCadA-M3為經過突變改造后pH耐受性有所改善的酶，即得重組大腸桿菌SC01。

2.根據權利要求1所述的一種耦合產戊二胺和丁二酸的重組大腸桿菌的構建，其特征在于，將經過突變改造后pH耐受性有所改善的賴氨酸脫羧酶基因EcCadA-M3，與載體pCDFDuet-1連接，并轉入克隆載體Trans1-T1，經過LB平板初篩后，挑點進行菌落PCR驗證后測序。

3.根據權利要求1所述的一種耦合產戊二胺和丁二酸的重組大腸桿菌的構建，其特征在于：制備高產丁二酸生產菌株E.coliAFP111的化轉感受態。

4.根據權利要求1所述的一種耦合產戊二胺和丁二酸的重組大腸桿菌的構建，其特征在于：將構建好的pCDFDuet- CadA-M3轉化至E.coliAFP111的化轉感受態中，得到E.coliSC01。

5.基于權利要求1構建所得重組大腸桿菌SC01在合成戊二胺和丁二酸上的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，L-賴氨酸脫羧酶在E.coliAFP111中的表達驗證；

步驟2，L-賴氨酸脫羧酶在宿主菌株E.coliAFP111 中表達后的酶活驗證；

步驟3，驗證EcCadA-M3的表達對宿主菌株E.coliAFP111的代謝過程中生物量及丁二酸產量的影響；

步驟4，將100 μL過夜培養的E.coliSC01種子液接種于100 mL含有34 mg/L Cm抗性、50mg/L Kana抗性、80 mg/L Sm抗性及15g/L葡萄糖的LB培養基中，于37oC，200 rpm條件下培養，當OD600達到0.6時，加入終濃度為0.5 mM的IPTG對菌株進行誘導，并繼續于37oC，200rpm條件下培養合成戊二胺，誘導20 h后，將補加了20 g/L葡萄糖的發酵液轉移到滅過菌且密封的藍蓋燒瓶中，向其中通入CO₂并維持2 min，確保體系的厭氧環境，厭氧培養生產丁二酸。