[發明專利]一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸

在審

• 申請號: 202010172954.6
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111411142A
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 陳可泉;許晟;王昕;馮嬌
• 申請（專利權）人: 南京凱諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P13/08;C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

本發明公開了一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D?賴氨酸。該方法包括以下步驟：構建重組菌株E.coli BL?pTrc99a?DapA；構建E.coli BL?pET28a?LYR葡萄糖代謝缺陷型菌株；選取重組菌株E.coli BL?pTrc99a?DapA和E.coli BL?pET28a?LYR加入發酵培養基中，葡萄糖和甘油為碳源，生產DL?賴氨酸，最后采用含有賴氨酸脫羧酶的粗酶液將DL?賴氨酸中L?賴氨酸轉化為1,5?戊二胺。與現有技術相比，降低了生產成本，終產物D?賴氨酸的產量提高。相比于利用E.coli BL?pET28a?LYR單一發酵生產，D?賴氨酸的摩爾收率提高了35%。

技術領域

本發明涉及D-賴氨酸制備技術領域，具體涉及一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸。

背景技術

D-賴氨酸在常溫常壓下穩定，呈針狀或片狀結晶，溶于水、酸，微溶于氯仿、乙醚、乙醇。其具有較好的抗菌性，在醫藥上具有較為重要的用途，它可以作為前體參與促黃體生成素釋放激素類似物的合成，它能夠抑制一些不是酶的蛋白質的糖基化，從而能夠預防糖尿病的一些并發癥。一些D-賴氨酸參與合成的藥物（口服和靜脈給藥）都可以大大減少腎對放射性肽的攝取，因此，相對于L-賴氨酸而言，D-賴氨酸更加適合用于癌癥的治療。以D-賴氨酸為原料合成的抗菌肽 CM15 能夠顯著增強細胞膜通透能力、能顯著降低細胞毒性、能夠防止蛋白酶水解。此外，D-賴氨酸的多聚體能夠刺激人腦星形膠質細胞和軟骨細胞的增殖，同時它也是一種藥物的良好載體。

目前，主要采用化學法、生物酶法或者化學與生物相偶聯的方法來進行D-賴氨酸的合成。其中由化學消旋獲得DL-賴氨酸的操作流程較為復雜，并且需要在高溫、強酸或強堿等較為苛刻的條件下進行。同時，化學法拆分DL-賴氨酸不僅收率不高，且手性拆分劑的價格較為昂貴，其價格往往會超出目的產物的價格。而采用生物酶法消旋制備D-賴氨酸則具有反應條件溫和、立體選擇性強、催化效率高等優點，此法已成為拆分或合成手性化合物的重要途徑。

酶法拆分是指利用從微生物細胞內分離出來的酶或者直接利用含有此酶微生物活細胞來進行手性化合物的拆分。酶拆分的獨特之處就在于酶蛋白質的活性中心是一個由L-氨基酸構成的不對稱環境。在一定條件下，酶這一特殊的的活性中心使得其只能與外消旋混合物中的一個對映體進行結合并發生某個反應，使其變為另一種與對映體的性質差別較大的化合物，從而達到拆分兩個對映體的目的。我國的科研工作者們也在相關領域作出了貢獻。如錢紹松等先將(DL)-茶氨酸經乙酰化生成(DL)-N-乙酰基茶氨酸，然后利用米曲霉氨基酰化酶拆分(DL)-N-乙酰基茶氨酸得L-茶氨酸，收率85%，光學純度為98%。黃冠華等在固定化青霉素酰化酶(IPA-750)存在下，通過N-苯乙酰-(DL)-苯丙氨酸的選擇性水解完成了酶法拆分(DL)-苯丙氨酸制備D-苯丙氨酸的過程，收率67%，光學純度達到91%。目前關于D-賴氨酸的酶促拆分的研究較少，主要有劉毅等先采用化學消旋法將L-賴氨酸消旋為DL-賴氨酸，再以蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei) 中的賴氨酸脫羧酶對DL-賴氨酸進行立體選擇性生物轉化，從30 g DL-賴氨酸中獲得8.5 g D-賴氨酸，收率為28%。Takahashi 等利用化學生物偶聯法，以L-賴氨酸鹽酸鹽為原料，通過化學消旋的方式得到質量濃度為100 g/L的DL-賴氨酸 反應液，再經加氧酶和脫氨酶將L-賴氨酸直接降解掉，最終，混合反應液中剩余47 g/L 的D-賴氨酸，結晶分離后D-賴氨酸的收率為38%。上述兩種方法都是采用先化學消旋后酶促拆分來合成D-賴氨酸，但是該方法的收率都不高，操作流程較為復雜且環境污染較大。

目前為止，通過將DapA和LYR分開表達在兩個細胞中，利用混菌發酵的方式，使得中間產物積累減少，提高DL-賴氨酸的產量，并通過酶促拆分法獲得終產物的D-賴氨酸生產方法尚未見報道。

發明內容