[發明專利]一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸

在審

• 申請號: 202010172954.6
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111411142A
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 陳可泉;許晟;王昕;馮嬌
• 申請（專利權）人: 南京凱諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P13/08;C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

1.一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，構建重組菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA；

步驟2，構建E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代謝缺陷型菌株；

步驟3，選取重組菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR加入發酵培養基中，以葡萄糖和甘油為碳源，培養至OD約為0.6時用IPTG誘導，繼續培養生產DL-賴氨酸；

步驟4，采用含有賴氨酸脫羧酶的粗酶液將DL-賴氨酸中L-賴氨酸轉化為1,5-戊二胺，從而獲得D-賴氨酸。

2.根據權利要求1所述的一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸，其特征在于，步驟1中E.coli BL-pTrc99a-DapA構建方法為：選取引物，通過PCR復制大腸桿菌MG1655上的二氫吡啶甲酸合酶，再與載體pTrc99a連接，并轉入克隆載體Trans1-T1，經過LB平板初篩后，挑點進行菌落PCR驗證后測序。

3.根據權利要求1所述的一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸，其特征在于，步驟1中E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代謝缺陷型菌株構建方法為：將來源于P. mirabilis BCRC10725 的基因LYR基因密碼子優化后交由金唯智公司合成于載體pET28a的NcoI /XhoI酶切位點之間，轉入克隆載體Trans1-T1，經過LB平板初篩后，挑點進行菌落PCR驗證后測序。

4.根據權利要求1所述的一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸，其特征在于，步驟2中所述E .coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代謝缺陷型菌株構建方法如下：利用Crispr-Cas9編輯技術敲除大腸桿菌BL21（DE3）的磷酸轉移酶系統(PTS) ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因編碼的蛋白，將構建好的質粒pET28a-LYR轉化至葡萄糖代謝缺陷型的BL21（DE3）的感受態中，即得E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代謝缺陷型菌株。

5.據權利要求1所述的一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸，其特征在于，步驟3中所述加入重組菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR的種子液細胞OD比為3：1。

6.根據權利要求1所述的一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸，其特征在于，步驟3中所述葡萄糖和甘油的添加的摩爾比為6：1。

7.根據權利要求1所述的一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸，其特征在于，步驟3中所述誘導溫度為35℃。

8.根據權利要求1所述的一種基于酶促拆分法的混菌發酵產D-賴氨酸，其特征在于，步驟4中所述含有賴氨酸脫羧酶的粗酶液中添加的終濃度為1mg/mL。