[發明專利]超高效液相色譜串聯質譜技術檢測尿液中8種兒茶酚胺及其代謝物的方法

在審

• 申請號: 202010172193.4
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111398448A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 成曉亮;李美娟
• 申請（專利權）人: 南京品生醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/38
• 代理公司: 南京思拓知識產權代理事務所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤

1.一種超高效液相色譜串聯質譜技術檢測尿液中8種兒茶酚胺及其代謝物的方法，

所述8種兒茶酚胺及其代謝物分別為：腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、變腎上腺素、去甲變腎上腺素、3-甲氧酪胺、高香草酸和香草扁桃酸；

所述8種兒茶酚胺及其代謝物對應的內標物分別為：腎上腺素-d3、去甲腎上腺素-d6、多巴胺-d4、變腎上腺素-d3、去甲變腎上腺素-d3、3-甲氧酪胺-d4、高香草酸-d3和香草扁桃酸-d3；

采用超高效液相色譜串聯質譜技術檢測經過預處理的尿液中的上述8種兒茶酚胺及其代謝物，先利用超高效液相色譜將待測物與尿液基質分離，再利用質譜同位素內標定量法，以標準品與內標物的濃度比為X軸，標準品與內標物的峰面積比為Y軸，建立校準曲線，計算上述8種兒茶酚胺及其代謝物的含量，具體色譜條件為：

(1)超高效液相色譜條件：

流動相A：0.05％～1％甲酸水溶液；流動相B：乙腈；

色譜柱型號：Agilent Pursuit PFP 2.0×150mm，3.0μm；

采用流動相A和流動相B為混合流動相進行梯度洗脫，所述梯度洗脫過程如下：在0-1.5分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由99:1勻速漸變至60:40；在1.5-2.0分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由60:40勻速漸變至2:98；在2.0-2.5分鐘內，流動相A和流動相B的體積比為2:98；在2.5-4.5分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由2:98勻速漸變至99:1；

(2)質譜條件：

在電噴霧電離檢測模式下，采用多反應監測的質譜掃描模式；噴霧電壓為0.5kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶劑溫度為150℃；霧化氣溫度為600℃，霧化氣流速為1000L/h，錐孔氣流速為150L/h；同時監測各目標物以及同位素內標。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述色譜柱為五氟苯基柱；所述流動相A為0.05％～0.5％甲酸水溶液；流速為0.2～1.0mL/min；柱溫為30～50℃；進樣體積為0.5～2μL。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，

所述流動相A為0.1％甲酸水溶液；所述流速為0.4mL/min；所述柱溫為40℃；所述進樣體積為1μL。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿液為人或動物的尿液。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述經過預處理的尿液按照如下方法制備：取過濾后的尿液于離心管中，向其中加入混合內標工作液，渦旋后取上清液。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，

所述經過預處理的尿液按照如下方法制備：取20μL過濾后的尿液于1.5mL離心管中，向其中加入780μL混合內標工作液，渦旋后取70μL上清液。

7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，

所述混合內標工作液按照如下方法制備：去甲腎上腺素-d6和變腎上腺素-d3以溶液形式購入，濃度均為100μg/mL；以30％～70％甲醇水溶液將腎上腺素-d3、多巴胺-d4、去甲變腎上腺素-d3、3-甲氧酪胺-d4、高香草酸-d3和香草扁桃酸-d3配制成濃度分別為2mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、1mg/mL、10mg/mL的同位素內標溶液；再以30％～70％甲醇水溶液將腎上腺素-d3、去甲腎上腺素-d6、多巴胺-d4、變腎上腺素-d3、去甲變腎上腺素-d3、3-甲氧酪胺-d4、高香草酸-d3和香草扁桃酸-d3的濃度分別稀釋至2μg/mL、8μg/mL、40μg/mL、4μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、800μg/mL、200μg/mL；再將上述內標液各取20μL加入到0.24mL稀釋液中，得混合內標液；最后取混合內標液200μL，加入1mL萃取液，再以78.8mL超純水稀釋，得混合內標工作液。