[發(fā)明專利]制備右旋酮洛芬的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010171547.3
• 申請(qǐng)日: 2020-03-12
• 公開（公告）號(hào): CN111378637A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林潔;王小龍;張枝;楊燕花;麥倩婷;李拓;龐嘉穎;李凱峰;屈代鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東莞市東陽(yáng)光生物合成藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/78
• 分類號(hào): C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽(yáng)

本發(fā)明提出了一種制備右旋酮洛芬的方法。該方法包括使酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下進(jìn)行脫氨基反應(yīng)，以便獲得右旋酮洛芬，所述酰胺酶來(lái)源于Agrobacterium。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于Agrobacterium的酰胺酶對(duì)右旋酰胺酮洛芬的特異性識(shí)別能力更強(qiáng)，使用來(lái)源于Agrobacterium的酰胺酶制備右旋酮洛芬，可大大提高右旋酮洛芬的ee值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及制備右旋酮洛芬的方法。

背景技術(shù)

酮洛芬是2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(NSAIDs)，此類藥物均具有一個(gè)手性中心，只有右旋體才具有抗炎抗風(fēng)濕和鎮(zhèn)痛作用，左旋體幾乎沒有藥理活性且毒副作用大。

目前，市售(S)-(+)－酮洛芬主要合成方法有傳統(tǒng)的化學(xué)合成法、手性拆分以及生物酶合成法。

化學(xué)合成法主要是不對(duì)稱合成可通過(guò)6步反應(yīng)，由烯丙醇通過(guò)sharpless環(huán)氧化制備得到(2S，3S)環(huán)氧化合物，再加入手性位移試劑，經(jīng)過(guò)對(duì)映體選擇性氫解后生成二醇，在RuO4/NaIO4的催化下，最終得到右旋酮洛芬，ee值達(dá)到98％這種方法的產(chǎn)率和對(duì)映體選擇性較為理想，但是均需要用到傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑以促使反應(yīng)快速進(jìn)行，而大部分催化劑毒性較高、易燃且會(huì)造成環(huán)境污染，還有可能引入有害的副產(chǎn)物。

另有手性拆分方法，有專利(專利01，CN101928214A)采用國(guó)內(nèi)廉價(jià)易得的(-)-葡辛胺作為拆分劑拆分(RS)-酮洛芬，按一定比例混合后升溫回流后降溫結(jié)晶，對(duì)酮洛芬利用率達(dá)70％。目前也有采用高分子印跡聚合物、色譜法對(duì)酮洛芬對(duì)映體進(jìn)行拆分。也有研究利用微生物酶法進(jìn)行酮洛芬拆分。也有研究利用紫外誘變得到的微生物菌株在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，利用菌體拆分(RS)-酮洛芬。也有研究利用諾維信脂肪酶435催化酮洛芬酯拆分，該研究中，大腸桿菌表達(dá)來(lái)自于古細(xì)菌的嗜熱酯酶，利用菌體催化酮洛芬乙酯反應(yīng)生成右旋酮洛芬。然而，利用酯酶的缺點(diǎn)在于拆分率和產(chǎn)物ee值都不理想，底物濃度偏低問(wèn)題也難以解決。

生物酶合成法可以一定程度是解決底物濃度和產(chǎn)物ee值偏低的問(wèn)題。目前已有利用腈水合酶和酰胺酶雙酶體系制備光學(xué)純酮洛芬的報(bào)道。但現(xiàn)有技術(shù)的轉(zhuǎn)化率或光學(xué)純度均較低，仍達(dá)不到生產(chǎn)要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本申請(qǐng)的發(fā)明人對(duì)酰胺酶進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)在特定菌中的酰胺酶對(duì)右旋酰胺酮洛芬的特異性識(shí)別能力強(qiáng)，右旋酮洛芬的轉(zhuǎn)化率和ee值高。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種用于右旋酮洛芬的合成的酶組合。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述組合包括：腈水合酶和酰胺酶，所述酰胺酶來(lái)源于Agrobacterium.。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于Agrobacterium.的酰胺酶對(duì)右旋酰胺酮洛芬的特異性識(shí)別能力更強(qiáng)，使用腈水合酶和來(lái)源于Agrobacterium.的酰胺酶的雙酶體系制備右旋酮洛芬，可大大提高右旋酮洛芬的轉(zhuǎn)化率和ee值。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述酶組合還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本年發(fā)明的實(shí)施例，所述酰胺酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。