[發明專利]牙上皮細胞外泌體制備、外泌體植入物的制備及其應用

有效

• 申請號: 202010171386.8
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111388504B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 喬鞠;陳國慶;張思誠
• 申請（專利權）人: 成都世聯康健生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/36;A61K9/06;A61K47/42;A61P1/02;A61L27/38;A61L27/24;A61L27/52;A61L27/54
• 代理公司: 成都環泰專利代理事務所(特殊普通合伙) 51242
• 代理人: 李斌;李輝

本發明公開了一種牙上皮細胞外泌體制備，包括以下步驟:(1)工程化牙上皮細胞系的處理；(2)工程化牙上皮細胞系上清液的獲取；(3)工程化牙上皮細胞系提取液的獲取；(4)工程化牙上皮細胞外泌體的獲取。本發明還公開了一種膠原凝膠復合工程化牙上皮細胞外泌體植入物的制備方法。本發明還公開了一種工程化牙上皮細胞外泌體在體內促進牙周和牙髓再生中的應用。利用永生化的赫特維希上皮細胞系(HERS?H1)長期穩定的擴增并且規模化制備牙上皮來源的外泌體。且由于外泌體不含有主要組織相容性復合體，避免了以干細胞為基礎的再生中面臨的免疫排斥問題，且外泌體易于儲存與運輸。

技術領域

本發明涉及生物醫學工程技術領域，具體來說，涉及一種牙上皮細胞外泌體制備、外泌體植入物的制備及其應用。

背景技術

牙周炎是中老年人常見的口腔疾病之一，會導致牙槽骨的吸收及牙齒的松動，最終導致牙齒脫落。目前臨床上以常規潔治刮治為主，只能延緩骨吸收進程，尚無根治的治療方法。因齲病、各種創傷等引起的牙髓病是世界上最常見的口腔感染性疾病之一，可導致牙髓的炎癥甚至壞死，然而根管治療作為目前最有效的牙髓治療手段，是以人工材料替代活性牙髓，造成牙髓的缺失，最終導致牙齒失活和牙齒脫落。組織工程技術的出現為牙周及牙髓組織修復開啟了新的里程。從牙齒發育的角度來看，牙髓及牙周組織的形成是牙上皮與間充質相互作用的結果。所以，利用牙源性上皮干細胞與間充質干細胞相互作用被廣泛應用于牙周及牙髓組織再生中。然而，牙源性干細胞的應用仍然有不少限制，例如干細胞獲取程序的繁瑣，牙源性干細胞數量的限制、細胞衰老以及潛在的致瘤風險等。

1983年，外泌體首次于綿羊網織紅細胞中被發現，1987年Johnstone將其命名為“exosome”。外泌體是由細胞分泌的一種雙層膜狀結構的小囊泡，直徑約40-150nm，攜帶了母細胞重要的信號分子，例如蛋白質、mRNA、miRNA和脂質等，通過與靶細胞的結合而調控細胞功能，參與細胞間交流。研究發現，在牙齒發育過程中，外泌體參與牙上皮及牙間充質的相互作用并在其中扮演重要角色。牙源性細胞外泌體可以保持著與其母細胞相似的生物學功能，牙源性上皮細胞來源的外泌體在促進牙源性間充質細胞向牙周組織分化及牙髓組織形成方面具有積極作用。

工程化的細胞系可以作為重要的科學研究工具，可以代替有限的原代細胞，實現長期并且穩定的細胞擴增。為解決原代牙上皮細胞來源少，取材困難的問題，本發明利用赫特維希上皮細胞系(HERS-H1)(該發明專利申請號為：201711205709.5，其中，赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1保藏號為CCTCC NO.C2017249)作為牙源性上皮細胞的來源，保證了工程化牙上皮細胞的長期穩定的擴展，并實現工程化牙上皮細胞外泌體規模化制備。同時，工程化牙上皮細胞外泌體也保持著與其母細胞相似的生物學功能，工程化牙上皮細胞來源的外泌體在促進牙周組織形成及牙髓組織再生方面具有積極的促進作用。

工程化牙上皮細胞外泌體在應用過程中也存在著許多難題，比如首先是外泌體支架材料的篩選，理想的支架材料首先需要安全無害，并且能夠粘附和緩釋外泌體，在體內可以逐漸吸收而不影響宿主的體內微環境；其次，因為外泌體的提取過程中會有一系列的物理化學操作，能否保證其安全無害上具有一定的難度。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種牙上皮細胞外泌體制備、外泌體植入物的制備及其應用，具有利用永生化的赫特維希上皮細胞系(HERS-H1)長期穩定的擴增并且規模化制備牙上皮來源的外泌體，且由于外泌體不含有主要組織相容性復合體，避免了以干細胞為基礎的組織再生中面臨的免疫源性問題，且外泌體具有易于儲存與運輸的優點。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種牙上皮細胞外泌體制備，包括以下步驟:

(1)工程化牙上皮細胞系的處理：

1.1、取液氮保存的工程化牙上皮細胞系(HERS-H1)，用40-50℃溫水復蘇，接種于10cm培養皿中；