[發(fā)明專利]牙上皮細(xì)胞外泌體制備、外泌體植入物的制備及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010171386.8
• 申請(qǐng)日: 2020-03-12
• 公開（公告）號(hào): CN111388504B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬鞠;陳國(guó)慶;張思誠(chéng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都世聯(lián)康健生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;A61K35/36;A61K9/06;A61K47/42;A61P1/02;A61L27/38;A61L27/24;A61L27/52;A61L27/54
• 代理公司: 成都環(huán)泰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 51242
• 代理人: 李斌;李輝

1.一種牙上皮細(xì)胞外泌體制備方法，其特征在于，包括以下步驟:

（1）工程化牙上皮細(xì)胞系的處理：

1.1、取液氮保存的工程化牙上皮細(xì)胞系HERS-H1，用40-50℃溫水復(fù)蘇，接種于10cm培養(yǎng)皿中；

1.2、加入含有2%胎牛血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，存放于35-38℃，4-5%CO₂ 的培養(yǎng)箱，24-26小時(shí)后換液，待細(xì)胞融合至80-95%用胰蛋白酶消化傳代；

1.3、待擴(kuò)增出10⁵-10⁸個(gè)細(xì)胞后，進(jìn)行工程化牙上皮細(xì)胞系提取液的提取；

（2）工程化牙上皮細(xì)胞系上清液的獲取：

2.1、轉(zhuǎn)移步驟1.3中獲取的工程化牙上皮細(xì)胞系至T75培養(yǎng)瓶中；

2.2、加入含2%胎牛血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，存放于 35-38℃，4-5%CO₂ 的培養(yǎng)箱中；

2.3、當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%-75%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗培養(yǎng)瓶底部2-3次，加入含有2%無(wú)外泌體血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，存放于 35-38℃，4-5%CO₂ 的培養(yǎng)箱中；

2.4、連續(xù)培養(yǎng)兩天后收集上清液，收集到的上清液以1900-2100g的轉(zhuǎn)速, 離心 28-32min，去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，棄沉淀；

（3）工程化牙上皮細(xì)胞系提取液的獲取：

取離心后的上清液放于100KD膜的離心過(guò)濾器中，以3-5℃的溫度，4500-5200g 的轉(zhuǎn)速離心 28-32min，進(jìn)行兩次離心，獲得的膜上清液即為工程化牙上皮細(xì)胞系提取液，提取液于-80℃的環(huán)境中進(jìn)行保存；

（4）工程化牙上皮細(xì)胞外泌體的獲取：

加入外泌體提取試劑至步驟（3）獲得的工程化牙上皮細(xì)胞系提取液中，牙上皮細(xì)胞系提取液和外泌體提取試劑用量比例為 1.8-2.2：1，在3-5℃下保存12-18小時(shí)，以 3-5℃的溫度、8000-12000g的轉(zhuǎn)速離心 50-70min，取沉淀，即得工程化牙上皮細(xì)胞外泌體；其中外泌體提取試劑為Total ExosomeIsolationTM reagent、ExoQuick-TC或exoEasy Maxi Kit。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牙上皮細(xì)胞外泌體制備方法，其特征在于，所述步驟1.1、取液氮保存的工程化牙上皮細(xì)胞系HERS-H1，用45℃溫水復(fù)蘇，接種于10cm培養(yǎng)皿中；

1.2、加入含有2%胎牛血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，存放于37℃，5%CO₂ 的培養(yǎng)箱，24-26小時(shí)后進(jìn)行換液，待細(xì)胞融合至90%用胰蛋白酶消化傳代。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牙上皮細(xì)胞外泌體制備方法，其特征在于，所述步驟2.3中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%-75%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗培養(yǎng)瓶底部2-3次，然后加入含有2%無(wú)外泌體血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，存放于 37℃，5%CO₂ 的培養(yǎng)箱中。

4.一種膠原凝膠復(fù)合工程化牙上皮細(xì)胞外泌體植入物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、將標(biāo)準(zhǔn)型的膠原凝膠置于冰上，同時(shí)預(yù)冷操作工具；

S2、按8:1:1比例分別向預(yù)冷的玻璃離心管中加入膠原凝膠、10×基礎(chǔ)培養(yǎng)基和緩沖液混合后放于冰上備用；

S3、取工程化牙上皮細(xì)胞外泌體用混合后的液態(tài)溶劑重懸，外泌體最終濃度為1.5-2.5mg/ml；

S4、轉(zhuǎn)移混有工程化牙上皮細(xì)胞外泌體的液態(tài)溶劑至預(yù)冷的玻璃管中，置于冰上保存；上述工程化牙上皮細(xì)胞外泌體為權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述制備方法得到的工程化牙上皮細(xì)胞外泌體。