[發明專利]基于熒光標記流式單分子計數的蛋白質含量計量基準方法

有效

• 申請號: 202010170831.9
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111289425B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 武利慶;楊彬;高運華;王迪;劉亞輝;金有訓;王晶
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N1/30;G01N1/38
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 解政文

本發明基于熒光標記流式單分子計數蛋白質含量絕對測量方法包括：將待測蛋白質純品用稀釋液配制成或分步稀釋至0.1mg/g?1mg/g，稀釋倍數記錄D₁；對稀釋后蛋白質分子進行熒光標記，使熒光染料與每個蛋白質分子結合；將溶液中標記好熒光標記蛋白質與過量熒光染料進行分離；用稀釋液對純化好的熒光標記蛋白質繼續稀釋至100?1000分子/μL濃度水平，稀釋倍數為D₂，測量溶液質量流速f，用單分子分析儀對熒光標記蛋白質溶液直接進行流式計數,得到單分子計數結果w；根據由單分子分析儀照射出來激光斑點和毛細管幾何尺寸算出檢測概率p；根據單分子計數結果w、質量流速f、稀釋倍數D和檢測概率p，計算蛋白質溶液質量濃度。

技術領域

本發明涉及生物化學檢測領域，特別是涉及一種基于熒光標記流式單分子計數的蛋白質含量計量基準方法。

背景技術

計量是實現單位統一、量值準確可靠的活動，研究建立高準確度的測量方法是計量學研究的重要內容之一。基準測量方法是一種具有最高計量學品質的測量方法，其操作可以被完全地描述和理解，最終不確定度可以用SI單位表述，測量結果不依賴被測量的測量標準。基準方法是形成量值源頭的依據。

隨著生命科學和生物技術的發展，生命科學已經經歷了從“描述生物學”向“實驗生物學”再向“創造生物學”發展的過程，當今的生物學已經成為精準定量的科學。沒有對生命體各類生命現象的精確測量，便難以對生命過程進行全方位的調控與干預。蛋白質作為一類重要的生物大分子，是生命活動的主要承擔者，在體內各個生命活動如營養代謝、酶催化、激素、免疫、遺傳、變異等過程中均離不開蛋白質功能的發揮。鑒于蛋白質生物體內的重要作用，它已經成為眾多領域的檢測靶標。例如在體外診斷中，常見的體外診斷項目中有一半以上檢測對象為蛋白質；在食品安全中，160多種食品含有可以導致過敏反應的食品過敏原，其中大于90％的過敏原都是蛋白質，根據國內食品標簽標識管理規定，相應的蛋白質過敏原均應被檢測并被標識；在生物醫藥領域，目前已經批準150多個蛋白質藥物上市，400多種蛋白質藥物處于臨床研究階段，3000多種處于臨床前研究階段。不論是體外診斷，還是食品安全與用藥安全，這些都關乎大眾健康與國計民生，相關領域蛋白質檢驗結果的準確可比則是保證大眾健康與安全的基石！

通過建立量值溯源傳遞體系來保證檢測結果的準確一致已經成為共識，是計量界的通行做法并在傳統的物理計量與化學計量領域得到廣泛和成功的應用。量值溯源傳遞體系的建立一是要有量值的源頭，二是要有量值傳遞方法，尤其是要有具有較高測量準確度的“基標準”方法，才能保證國家基準復現的量值能夠準確的傳遞到下一級的標準物質或工作計量器具上。高準確度量值傳遞方法的缺乏將導致即使國家基準能夠復現出量值，也無法準確的傳遞下去，從而使得保證檢測結果的準確可比成為空談。因此，高準確度的計量方法研究在計量及量值溯源傳遞中具有舉足輕重的作用。

蛋白質含量是蛋白質的基本屬性，它描述了被定義的“蛋白質分子”數量的多少，是蛋白質測量的基本量值，在各類蛋白質檢測項目中占到了80％以上。因此，要保證蛋白質含量檢測結果的準確可比，必須研究建立高準確度的蛋白質含量計量方法，才能實現蛋白質量值的準確傳遞，從而達到檢測結果準確可比、實現檢測結果的互通與互認、保證貿易公平、保護人民大眾健康的目的。

蛋白質含量測量方法按照測量準確度可以分為常規測量方法和高準確度的計量(潛)基準測量方法，常用的計量(潛)基準方法包括同位素稀釋質譜法、質量平衡法和定量核磁法。按照測量原理可以分為滴定法、光譜法、色譜法、質譜法、電泳法、波譜法、綜合法等，例如，常用的凱氏定氮、微量凱氏定氮等屬于滴定法；雙縮脲法、Folin-酚法(Lowry法)、考馬斯亮藍法等屬于比色光譜法。按照測量過程中是否需要上一級標準，可以分為蛋白質含量絕對測量方法和相對測量方法兩類。蛋白質含量絕對測量方法在測量過程中不需要同樣的標準物質作為標準，而相對測量方法在測量過程中需要相應的標準物質繪制標準曲線，或者通過括弧法或單點法進行定量。質量平衡法、定量核磁法、凱氏定氮法屬于絕對測量方法，而同位素稀釋質譜法、液相色譜法、比色法等大多數蛋白質含量測量方法都屬于相對測量方法。