[發明專利]基于熒光標記流式單分子計數的蛋白質含量計量基準方法

有效

• 申請號: 202010170831.9
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111289425B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 武利慶;楊彬;高運華;王迪;劉亞輝;金有訓;王晶
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N1/30;G01N1/38
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 解政文

1.一種基于熒光標記流式單分子計數的蛋白質含量絕對測量方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)用含有表面活性劑、有機溶劑和緩沖鹽的水溶液作為稀釋液，將蛋白質固體配制成0.1mg/g-2mg/g的待測蛋白質溶液，記錄稀釋倍數D₁＝1；或用上述稀釋液來稀釋經過粗測的濃度的待測蛋白質溶液至0.1mg/g-2mg/g，記錄稀釋倍數D₁，得濃度為0.1mg/g-2mg/g的待測蛋白質溶液；

(2)將熒光染料加入到上述濃度為0.1mg/g-2mg/g的待測蛋白質溶液中，對溶液中的蛋白質分子進行標記，使熒光染料與每個蛋白質分子充分結合，形成熒光標記蛋白質分子，得到標記好的溶液；

(3)將標記好的溶液中的熒光標記蛋白質分子與過量熒光染料進行分離，收集被截留的熒光標記蛋白質分子組分，除去過量的未結合的染料，得到純化好的熒光標記蛋白質分子；

(4)用步驟(1)的稀釋液對純化好的熒光標記蛋白質分子進行稀釋，稀釋到100-1000分子/μL的濃度水平，稀釋倍數為D₂，得到稀釋了D₂倍的熒光標記蛋白質溶液；

(5)采用單分子分析儀對稀釋D₂倍的熒光標記蛋白質溶液直接進行流式計數,得到單分子計數結果w，單位為個數 /min，為了測定單分子分析儀的質量流速，用純水在指定時間內流過單分子分析儀的質量和上述指定的時間之比，得到單分子分析儀的質量流速f，單位為mg/min；

(6)根據由單分子分析儀照射出來的激光斑點和毛細管組成的檢測區域與液體占據的幾何區域的體積之比，計算出檢測概率p；

(7)根據單分子計數結果w、質量流速f、稀釋倍數D和檢測概率p，計算待測蛋白質溶液的質量濃度：

其中：

c——待測蛋白質的質量濃度，mg/g；

M——待測蛋白質的摩爾質量，g/mol；

D——進行單分子計數分析時的稀釋倍數，D＝D₁×D₂,無量綱；

N_A——阿伏伽德羅常數，mol^-1；

f——質量流速，mg/min；

w——熒光分子計數，個數/min；

p——檢測概率，無量綱。

2.根據權利要求1所述的基于熒光標記流式單分子計數的蛋白質含量絕對測量方法，其特征在于：在所述步驟(1)中，所述的蛋白質為純度大于99％的蛋白質，用SDS-PAGE、凝膠排阻高效液相色譜、反相高效液相色譜、離子交換高效液相色譜、芯片電泳、毛細管電泳或雙向電泳來檢測待測蛋白質的純度，所述粗測的濃度為用紫外吸收、考馬斯亮藍、Bradford或高效液相色譜方法進行的。

3.根據權利要求2所述的基于熒光標記流式單分子計數的蛋白質含量絕對測量方法，其特征在于：所述的稀釋液溶液包含：占稀釋液溶液體積0.1％～10％的表面活性劑和占稀釋液溶液體積0.1％～30％的有機溶劑，表面活性劑為吐溫20或HEPES；有機溶劑為乙腈、甲醇或異丙醇；緩沖鹽為磷酸鹽、醋酸鹽或硼酸鹽；用磷酸、乙酸或硼酸調整稀釋液溶液的pH值，使稀釋液溶液的等電點與待測蛋白質的等電點相同。

4.根據權利要求2所述的基于熒光標記流式單分子計數的蛋白質含量絕對測量方法，其特征在于：所述的稀釋液溶液包含10mM～100mM的磷酸鹽；或者包含0.1M～1.0M的醋酸鹽；或者包含0.1M～1.0M的硼酸鹽。