[發明專利]一種水產品中類胡蘿卜素的高通量檢測方法

有效

• 申請號: 202010169115.9
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111307976B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 李雙;陳娟娟;徐繼林;陳海敏;楊銳;駱其君;吳瑋
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 北京識然知識產權代理事務所(普通合伙) 11975
• 代理人: 曾慶國

本發明公開了一種水產品中類胡蘿卜素的高通量檢測方法，包括以下步驟：A.前處理；B.將待檢測的樣品溶液經高效液相色譜?四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀檢測，得到待檢測樣品溶液的高效液相色譜圖；C數據分析。本發明公開的一種水產品中類胡蘿卜素的高通量檢測方法具有以下有益效果：1、類胡蘿卜素測定低限為0.05mg/kg，標準曲線在10ng/mL～200ng/mL線性范圍內良好；2、前處理結合了固相萃取和基體分散凈化技術，通過一次前處理，實現了理化性質差異很大的3大類類胡蘿卜素的提取、凈化工作，在提高檢測效率的同時降低了昂貴的時間、試劑成本消耗；3、本方法應用于水產品，共檢測到類胡蘿卜素種類50種。

技術領域

本發明涉及水產品營養成分檢測領域，尤其涉及一種水產品中類胡蘿卜素的高通量檢測方法。

背景技術

類胡蘿卜素，是一類天然色素分子，主要存在于魚、蝦、蟹、貝殼等水產生物體中，其結構組成與分布是評價水產品品質的重要指標。這些光敏性的類胡蘿卜素除了作為機體、組織的著色劑，提高感官品質外，還能增強水產生物對環境的適應能力和一些重要的生理功能，包括提高育苗效率，抗病力等。研究表明：水產生物不能從頭合成類胡蘿卜素，但是可將膳食類胡蘿卜素進行轉化或直接吸收，每種生物都有自己獨有的類胡蘿卜素，甚至不同組織之間都有其特殊性，這也是水產品中類胡蘿卜素種類較多的原因之一。

類胡蘿卜素種類眾多，按照化學結構劃分為三大類：第一類是游離胡蘿卜素，它們的分子中沒有氧，是一類高度不飽和的碳氫化合物，多呈現橘紅色，比如α,β-胡蘿卜素等；第二類是含氧胡蘿卜素，它們是胡蘿卜素的氧化衍生物，在分子兩頭的環中含有一個或多個氧分子，最常見的修飾基團有羥基、甲氧基、羰基、羧基等，比如葉黃素、蝦青素等，前兩類統稱為非酯化類胡蘿卜素；第三類是胡蘿卜素酯，包括單酯和雙酯，是自由類胡蘿卜素與內源性脂肪酸再酯化的結果。

傳統檢測水產品體內類胡蘿卜素的前處理技術主要是直接溶劑萃取。該技術僅采用單一溶劑進行提取(多采用丙酮)，存在選擇性弊端，尤其對小分子游離類胡蘿卜素及其代謝產物，和低極性類胡蘿卜素酯不能同時兼容；且沒有針對提取液基質屬性進行凈化處理，僅僅適用于固定食品基質中某一類胡蘿卜素檢測的分析方法，樣品處理通量不高。類胡蘿卜素種類眾多，不少水產品中類胡蘿卜素及其代謝產物還未得到分離和鑒定，而建立全面高效的前處理方法，是保證未知化合物被鑒定的重要前提，對于完善水產品中類胡蘿卜素種類，探究其代謝通路具有非常重要的意義。因此，需要尋求一種更為全面、高效的方法對水產品體內類胡蘿卜素種類進行檢測。

類胡蘿卜素常用的儀器分析方法，包括：液相-紫外可見光吸收光譜和液相-三重四極桿質譜等。大部分類胡蘿卜素在紫外中存在三個最大吸收峰，俗稱“三指峰”，可對類胡蘿卜素總量進行分析，但是無法對基質中類胡蘿卜素的存在形式(自由、酯合、氧化)進性鑒定。目前，類胡蘿卜素研究多采用液相-三重四極桿質譜技術，它需要已知待測化合物的特征離子碎片，通過多反應離子檢測模式針對性地獲取數據，進而實現已知化合物進行定性、定量分析。

發明內容

本發明的目的是為了彌補現有水產品類胡蘿卜素檢測方法所存在的選擇性弊端、檢出種類少、檢測效率低等缺點，提供了一種適用于水產品中類胡蘿卜素的高通量檢測方法。

考慮到類胡蘿卜素覆蓋種類眾多，不同類別之間極性差異較大；且水產品具有的高蛋白質、高脂肪的基質屬性，進而產生強烈的基質效應，導致檢測結果嚴重偏離。因此，根據提取溶劑的pKa值及極性范圍，本發明采用分級凈化提取：第一級采用甲醇振蕩提取、HLB小柱凈化，可實現對非酯化類胡蘿卜素(大部分游離類胡蘿卜素和含氧類胡蘿卜素)的有效提取分離；第二級采用甲醇提取，二氯甲烷輔助提取、中性氧化鋁粉凈化，去除油脂的同時，可實現對酯化類胡蘿卜素的提取分離。通過合并第一、二級提取液，并采用高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜(HPLC-Q-Orbitrap-HRMS)進行數據分析，即可實現對水產品中常見類胡蘿卜素的高通量檢測。

技術方案：一種水產品中類胡蘿卜素的高通量檢測方法，包括以下步驟：