[發(fā)明專利]一種水產(chǎn)品中類胡蘿卜素的高通量檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010169115.9 | 申請日： | 2020-03-12 |
| 公開（公告）號： | CN111307976B | 公開（公告）日： | 2022-06-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李雙;陳娟娟;徐繼林;陳海敏;楊銳;駱其君;吳瑋 | 申請（專利權(quán)）人： | 寧波大學(xué) |
| 主分類號： | G01N30/02 | 分類號： | G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86 |
| 代理公司： | 北京識然知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11975 | 代理人： | 曾慶國 |
| 地址： | 315211 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 水產(chǎn)品 類胡蘿卜素 通量 檢測 方法 | ||
1.一種水產(chǎn)品中類胡蘿卜素的高通量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
A.前處理：
(A1)稱取1g待檢測水產(chǎn)品，加入10mL含0.1wt％2,6-二叔丁基對甲酚的甲醇溶液中，震蕩5min，超聲提取20min，再以12000r/min的轉(zhuǎn)速在4～10攝氏度下離心5～10min，完成后得到有機相及殘渣；
(A2)取步驟(A1)得到的有機相，并向其中加入至少4倍體積的水得到上樣液，然后將上樣液經(jīng)HLB柱凈化得到凈化后的上樣液，然后通過氮吹將凈化后的上樣液濃縮至2.0ml，然后通過含0.1wt％HF的甲醇溶液定容至2.0ml，得到定容后的凈化上樣液，其中：
HLB柱凈化采用含0.1wt％2,6-二叔丁基對甲酚的甲醇溶液作為洗脫液進行洗脫；
(A3)將步驟(A1)的剩余殘渣加入10mL含0.1wt％2,6-二叔丁基對甲酚的甲醇-二氯甲烷溶液中，震蕩5min，超聲提取20min，以12000r/min的轉(zhuǎn)速在4～10攝氏度下離心5～10min，完成后得到有機相及殘渣，其中：
甲醇-二氯甲烷溶液中，甲醇與二氯甲烷的體積比為1:1；
(A4)取步驟(A3)得到的有機相，氮吹濃縮至體積不在變化，然后通過含0.1wt％HF的甲醇溶液定容至2.0ml，再向其中加入1g中性氧化鋁粉充分震蕩，以12000r/min的轉(zhuǎn)速在4～10攝氏度下離心5～10min，完成后得到上清液及沉淀；
(A5)合并步驟(A2)得到的定容后的凈化上樣液和步驟(A4)得到的上清液，然后過孔徑為0.22μm的濾膜得到待檢測的樣品溶液；
B.將步驟(A5)得到的待檢測的樣品溶液經(jīng)高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀檢測，得到待檢測樣品溶液的高效液相色譜圖，其中，儀器條件如下：
高效液相參數(shù)：
色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C8柱2.1mm x 100mm,粒徑3.5μm；
流動相A：含有0.1％甲酸+2mM甲酸銨的水溶液；
流動相B：含有0.1v/v％甲酸+15v/v％異丙醇的甲醇溶液，流速:0.8mL/min，進樣量:5.0μL，分流比1:4進樣，梯度見下表:
正、負(fù)離子模式梯度洗脫程序
質(zhì)譜參數(shù)：質(zhì)譜在正/負(fù)離子轉(zhuǎn)換模式下進行全掃描測定，質(zhì)量范圍：m/z 200～1500，分辨率70000，自動增益控制目標(biāo)值5*e5；負(fù)離子模式2900V，正離子模式3800V，離子傳輸管溫度為350℃，去溶劑氣氮氣流速：35L/h，輔助氣氮氣流速：15L/h，氣化室溫度400℃；在樣品運行前對儀器分別進行正負(fù)離子校正；二級采用自動觸發(fā)模式，分辨率35,000，自動增益控制目標(biāo)值2*e5，碰撞能量范圍10-80％，保留時間根據(jù)目標(biāo)物保留時間±1.0min；
C數(shù)據(jù)分析
C1繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：
取α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、蝦青素、巖藻黃素、紫玉米黃素、角黃素、葉黃素、梳黃質(zhì)、隱黃質(zhì)、硅甲藻黃素、二氫葉黃素、海膽酮、巖藻黃酮醇、新黃質(zhì)、多甲藻素、多甲藻黃素醇、尿酸內(nèi)酯、貽貝黃素、玉米黃素、扇貝醇酮、硅藻黃素、羥基海膽酮、甲藻黃素、果膠黃質(zhì)、隱藻黃素、亞油酸蝦青素單酯、雙棕櫚酸蝦青素酯，配制成不同濃度的混合的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照步驟B相同條件進行測試，得標(biāo)準(zhǔn)工作液的高效液相色譜圖，分別對各個標(biāo)準(zhǔn)品，按照其濃度和峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到上述標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
C2對于沒有標(biāo)準(zhǔn)品的類胡蘿卜素單、雙酯，則根據(jù)脂肪酸鏈數(shù)量對應(yīng)選擇結(jié)構(gòu)類似的亞油酸蝦青素單酯標(biāo)準(zhǔn)曲線或雙棕櫚酸蝦青素酯標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行相對定量分析；
C3根據(jù)步驟(B)得到的待檢測樣品溶液的高效液相色譜圖、對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及亞油酸蝦青素單酯標(biāo)準(zhǔn)曲線、雙棕櫚酸蝦青素酯標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品溶液中各待測成分的濃度，
以公式(1)計算待檢測水產(chǎn)品中類胡蘿卜素的含量：
X＝C*V/m*1000
式中：
X－試樣中待測物含量，單位為mg/kg；
C－試樣處理液中待測物濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、亞油酸蝦青素單酯標(biāo)準(zhǔn)曲線或雙棕櫚酸蝦青素酯標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到，單位為μg/L
V—定容體積，單位為mL；
m－試樣體積或質(zhì)量，單位為g，其中：
步驟C2中的沒有標(biāo)準(zhǔn)品的類胡蘿卜素酯包括蝦青素雙酯-20:3/20:1、蝦青素雙酯-20:3/18:2、蝦青素雙酯-22:6/18:1、蝦青素雙酯-20:4/20:5、蝦青素雙酯-20:5/20:5、蝦青素雙酯-22:6/16:0、蝦青素雙酯-22:6/16:1、蝦青素雙酯-20:5/16:0、蝦青素雙酯-22:6/14:0、蝦青素雙酯-20:5/16:1、蝦青素雙酯-18:1/16:0、蝦青素雙酯-16:0/16:0、蝦青素雙酯-22:6/20:5、蝦青素雙酯-20:5/18:1、蝦青素單酯-18:2、蝦青素單酯-16:0、蝦青素單酯-18:1、蝦青素單酯-22:6、蝦青素單酯-20:1、蝦青素單酯-20:5、蝦青素單酯-16:1、蝦青素單酯-20:4、蝦紅色素雙酯-22:6/16:0、金盞花黃素雙酯-22:6-20:6和金盞花黃素雙酯-22:6-16:0。
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