[發明專利]小鼠皮層中的8種氨基酸的檢測方法

在審

• 申請號: 202010169091.7
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111307975A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 蔣心惠;張靜;李建沙;劉永紅;龔濤;黃素瓊
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種測定小鼠皮層中的8種氨基酸的檢測方法，包括以下幾個步驟：步驟一、標準品的配制；步驟二、小鼠皮層的取樣；步驟三、除皮層樣品中的蛋白質；步驟四、衍生試劑的配制和衍生化反應；步驟五、HPLC?FLD分離測定皮層樣品中的8種氨基酸；步驟六、結果計算。本發明提供的小鼠皮層中8種氨基酸檢測方法具有操作簡便、結果準確度和靈敏度高的優點，可實現樣品中8種氨基酸的快速檢測。

技術領域

本發明涉及醫藥化學檢測領域，更具體地說，本發明涉及一種小鼠皮層中的8種氨基酸的檢測方法。

背景技術

氨基酸是構成生命體的重要基礎物質，腦組織中的氨基酸類神經遞質在中樞神經系統中參與調節生理活動，已有研究表明，腦內氨基酸水平的異常與腦部疾病的發生關系密切，如抑郁癥、腦缺血、阿爾茲海默癥等。天冬氨酸和谷氨酸屬于中樞神經系統的興奮性氨基酸，谷氨酸中樞神經系統中含量最多。它們能夠調節腦部的發育，但過量會有神經毒性作用，損傷中樞神經系統。γ-氨基丁酸和甘氨酸屬于中樞神經系統的抑制性氨基酸，γ-氨基丁酸由谷氨酸脫羧酶在神經末梢生成，對中樞神經系統起到抑制作用，調節腦內各種神經遞質的水平，有抗焦慮的作用。甘氨酸通過作用NMDA受體，對腦缺血和空間記憶有雙向調節作用；谷氨酰胺具有保護大腦，調節情緒，學習的作用。絲氨酸是合成嘌呤、嘧啶、膽堿的前體物質。精氨酸在腦中促進生長激素的合成。牛磺酸是含硫氨基的氨基酸，在腦內分布廣泛，含量豐富，具有改善記憶，促進垂體激素分泌的作用。

目前，對氨基酸的測定常用方法有液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)，高效液相色譜法(HPLC)。盡管液相色譜-質譜法靈敏度高、特異性好，但其設備價格昂貴而不能廣泛使用。通過優化色譜條件、預處理條件，衍生方法來提高高效液相色譜的靈敏度與準確度。本實驗以β-氨基丁酸為內標物質，OPA為衍生試劑，采用柱前衍生的方法建立一種靈敏度高、分離效能高、操作簡便的測定小鼠皮層中氨基酸的方法。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種小鼠皮層中氨基酸含量的檢測方法。

為了實現根據本發明的這些目的，提供了一種測定小鼠皮層中8種氨基酸含量的檢測方法，包括以下步驟：

步驟一、標準品的配制；

步驟二、小鼠皮層取樣；

步驟三、除皮層樣品中的蛋白質；

步驟四、衍生試劑的配制和衍生化反應；

步驟五、HPLC-FLD分離測定皮層樣品中的8種氨基酸；

步驟六、結果計算。

優選的是，步驟一中對標準品的配制的具體方法為：

以天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸為標準品，分別用超純水配制成1.0mg/mL的儲備液，備用。

優選的是，步驟二中小鼠皮層取樣的具體方法為：

取小鼠斷頭處死，立即剪開頭皮，除去硬腦膜和頭蓋骨，在冰皿上分離出大腦皮層，用生理鹽水洗去殘血，吸干水分，稱重，在玻璃勻漿器中加入1:1(m/v)體積的去離子水進行勻漿，勻漿液置于-80℃冰箱內保存備用。

優選的是，步驟三中除皮層中的蛋白質的具體方法為：

取步驟二中的皮層勻漿液，加入按1mg/μL的比例體積的內標物β-氨基丁酸(600mg/mL)溶液，加入與皮層勻漿液體積比為1:5的乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻1min，10000×g，4℃離心10min，取上清液，用超純水稀釋20倍供HPLC-FLD測定。

優選的是，步驟四中衍生試劑OPA的配制的具體方法為：