[發明專利]小鼠皮層中的8種氨基酸的檢測方法

在審

• 申請號: 202010169091.7
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111307975A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 蔣心惠;張靜;李建沙;劉永紅;龔濤;黃素瓊
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種小鼠皮層中的8種氨基酸含量的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、標準品溶液的配制；

步驟二、小鼠皮層的取樣；

步驟三、除皮層樣品中的蛋白質；

步驟四、衍生試劑的配制和衍生化反應；

步驟五、HPLC-FLD分離測定皮層樣品中的8種氨基酸；

步驟六、結果計算。

2.如權利要求1所述的小鼠皮層中的氨基酸含量的檢測方法，其特征在于，步驟一中對標準品的配制具體方法為：

以天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸為標準品，分別用超純水配制成1.0mg/mL的儲備液，備用。

3.如權利要求1所述的小鼠皮層中的氨基酸含量的檢測方法，其特征在于，步驟二中的小鼠皮層的取樣的具體方法為：

取小鼠斷頭處死，立即剪開頭皮，除去硬腦膜和頭蓋骨，在冰皿上分離出大腦皮層，用生理鹽水洗去殘血，吸干水分，稱重，在玻璃勻漿器中加入1:1(m/v)體積的去離子水進行勻漿，勻漿液置于-80℃冰箱內保存備用。

4.如權利要求1所述的小鼠皮層中的氨基酸含量的檢測方法，其特征在于，步驟三中除去皮層中的蛋白質的具體方法為：

取步驟二中的皮層勻漿液，加入按1mg/μL的比例體積的內標β-氨基丁酸(600mg/mL)溶液，加入與皮層勻漿液體積比為1:5的乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻，10000×g，4℃離心10min，取上清液，用超純水稀釋20倍供HPLC-FLD測定。

5.如權利要求1所述的小鼠皮層中的氨基酸含量的檢測方法，其特征在于，步驟四中衍生化試劑OPA的配制的具體方法為：

精密稱取鄰苯二甲醛(OPA)16.1mg于10mL的EP管內，加入0.4mL的甲醇溶解，再加入3.57mL的10mmol/L的硼酸鈉緩沖溶液(用飽和NaOH溶液調pH至10.0)，加入30μLβ-巰基乙醇，渦旋混勻，得濃度為4.0mg/mL的OPA溶液，于4℃避光保存備用。

步驟四中衍生化反應的具體方法為：

使用時取100μL標準品工作液或者樣品溶液，加入50μL的OPA衍生化試劑，立即在室溫下渦旋混勻30s，靜置1min，進樣20μL進行分析。

6.如權利要求1所述的小鼠皮層中的氨基酸含量的檢測方法，其特征在于，步驟五中HPLC-FLD分離測定皮層樣品中的8種氨基酸，測定條件如下：

檢測器：Waters 2475型熒光檢測器

色譜柱：依利特ODS(4.6×250mm，5μm)

流動相A：甲醇；

流動相B：乙酸鈉水溶液，pH＝6.0

梯度洗脫程序為：0-7min：10％-40％A；7.01-9min：40％A；9.01-10min：40％-60％A；10.01-18min：60％A；18.01-19min：50％A；19.01-20min：70％A；

柱溫：35℃；

流速：1.0mL/min；

檢測波長：激發波長：340nm發射波長：450nm

進樣量：20μL。

7.如權利要求1所述的小鼠皮層中的氨基酸含量的檢測方法，其特征在于，步驟六中結果計算具體為：

按公式(1)計算天冬氨酸的含量；按公式(2)計算谷氨酸的含量；按公式(3)計算谷氨酰胺的含量；按公式(4)計算絲氨酸的含量；按公式(5)計算甘氨酸的含量；按公式(6)計算精氨酸的含量；按公式(7)計算牛磺酸的含量；按公式(8)計算γ-氨基丁酸的含量；

Y＝0.072X+0.0019 (1)

Y＝0.1356X+0.0001 (2)

Y＝0.3045X+0.0127 (3)

Y＝0.2231X+0.0127 (4)

Y＝0.3971X+0.0172 (5)

Y＝0.1985X-0.0032 (6)

Y＝0.3577X+0.0028 (7)

Y＝0.3077X-0.003 (8)

式中：

Y：待測物與內標物質的峰面積之比；

X：待測物的濃度，單位為微克每毫升。