[發明專利]一種先天性無虹膜致病基因突變檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202010164873.1
• 申請日: 2020-03-11
• 公開（公告）號: CN111321215A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 原慧萍;王琦;邵正波;劉鑫娜;孫禹
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

本發明公開了一種先天性無虹膜致病基因突變檢測試劑盒及其應用。所檢測的致病基因突變是PAX6基因第2外顯子的第140位腺嘌呤核苷酸突變為胞嘧啶核苷酸，即NM_000280.3:c.140 AC。本發明所提供的用于檢測該先天性無虹膜致病突變的試劑盒，包括：10×PCR反應緩沖液、25mM dNTPs、DNA聚合酶、PCR擴增引物對、ddH₂O，所述的PCR擴增引物對由引物1(SEQ ID NO:1所示)和引物2(SEQ ID NO:2)組成。本發明提供了一種新的先天性無虹膜檢測手段，可為臨床已經確診為先天性無虹膜的患者提供基因診斷及遺傳咨詢，并可為表型尚未明確的眼部異常患者提供基因診斷進而指導臨床。

技術領域

本發明涉及一種基因點突變檢測試劑盒及其應用，特別涉及一種先天性無虹膜相關的PAX6基因點突變檢測試劑盒及其應用。本發明屬于基因診斷制品制備技術領域。

背景技術

先天性無虹膜是一種嚴重影響患者生存質量的眼部發育性疾病,主要表現為先天性虹膜發育不全、虹膜組織部分或全部缺失，也可伴有房角、晶狀體、角膜發育異常及黃斑和視神經發育不全。部分患者在兒童期可出現視力下降、畏光、眼球震顫。該病患者的眼部病變常隨著年齡增長而加重,對視功能的影響也日趨嚴重，伴有眼部其他病變的患者可出現青光眼、白內障或角膜混濁甚至盲。而國內臨床尚無有效的人工虹膜替代治療，目前治療主要集中在并發癥的防治上。

全球先天性無虹膜的發病率約為5～10萬分之一，約2/3的人有家族史，呈常染色體顯性遺傳，大約90％的患者發病與PAX6基因突變有關，因此通過PAX6基因檢測，有助于患者獲得明確的基因診斷，且對于無癥狀的家屬進行致病基因檢測更有助于早期發現疾病、早期治療，且可用于產前診斷，避免新生兒患有此病。

Sanger測序法是目前基因檢測的國際金標準，發展已相當完善,成本也降低了10倍以上,因此利用Sanger測序進行PAX6基因檢測，具有成本低、準確度高的優點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種先天性無虹膜致病基因突變檢測試劑盒及其應用。本發明補充現有先天性無虹膜基因檢測位點，利用新發現的PAX6基因點突變：NM_000280.3:c.140AC(NP_000271.1:p.Gln47Pro)提供一種迅速檢測先天性無虹膜的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

本發明的一種先天性無虹膜致病基因突變檢測試劑盒，包括：25mM dNTPs，10×PCR反應緩沖液，DNA聚合酶，PCR擴增引物對和ddH₂O，所述的PCR擴增引物對由引物1和引物2組成，其中，引物1的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，引物2的核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示，所述的致病基因是PAX6基因，PAX6基因的cDNA的NCBI參考序列號為NM_001204399，所對應的蛋白質NCBI參考序列號為NP_001191328，以cDNA第一個核苷酸作為1計算，該基因第2外顯子的第140位腺嘌呤核苷酸突變為胞嘧啶核苷酸，即c.140AC。

其中，突變前PAX6基因第2外顯子及其臨近的內含子核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，突變后PAX6基因的第2外顯子及其臨近的內含子核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

其中，優選的，所述的試劑盒利用PCR技術進行先天性無虹膜致病基因的擴增，反應程序為：

98℃預變性2分鐘，然后進入第一個循環：98℃變性10秒、63℃退火復性15秒、72℃延伸15秒，共進行40個循環，72℃1min，4℃保存。

進一步的，本發明還提出了所述的試劑盒在制備先天性無虹膜致病基因突變檢測試劑中應用。

該試劑盒利用PCR技術進行先天性無虹膜致病基因PAX6的擴增，擴增后針對PCR產物目的片段進行Sanger測序，比對測序結果即可得出待測樣品是否發生c.140AC突變。