[發(fā)明專利]利用枯草芽孢桿菌和核酸內(nèi)切酶制備人堿性成纖維細(xì)胞生長因子

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010164821.4
• 申請日: 2020-03-11
• 公開（公告）號: CN111235174A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鐘樹根;鄺緯陽
• 申請（專利權(quán)）人: 夢芊科技知識產(chǎn)權(quán)有限公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12P21/02;C07K1/22;C07K1/18;C12R1/125
• 代理公司: 北京高文律師事務(wù)所 11359
• 代理人: 王冬;韓威威

本發(fā)明涉及利用枯草芽孢桿菌和核酸內(nèi)切酶制備人堿性成纖維細(xì)胞生長因子。具體而言，本發(fā)明提供一種核酸構(gòu)建體，其包含插入物，所述插入物從5’端到3’端包含編碼短肽親和標(biāo)簽、來源于魚腥藻屬(Anabaena sp.)的反式剪接內(nèi)含肽、以及外源多肽的多核甘酸序列，其中所述短肽親和標(biāo)簽作為所述反式剪接內(nèi)含肽的N?端外顯肽，并且所述外源多肽作為所述反式剪接內(nèi)含肽的C?端外顯肽。本發(fā)明還提供了包含該構(gòu)建體的表達(dá)載體以及宿主細(xì)胞，以及一種產(chǎn)生和純化外源蛋白的方法。通過本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)和方法，能夠顯著提高具有生物活性的外源蛋白的表達(dá)效率，減少包涵體的產(chǎn)生，簡化了純化步驟，大幅度降低純化成本，特別適合規(guī)模化培養(yǎng)使用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，并且一般地涉及用于表達(dá)外源多肽的系統(tǒng)和方法。

背景技術(shù)

高效且成本有效地表達(dá)天然形式的外源多肽、尤其是細(xì)胞因子對于細(xì)胞生物學(xué)例如干細(xì)胞的研究日益重要。以人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growthfactor，簡稱bFGF，也稱為FGF2)為例。bFGF是成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，在神經(jīng)退行性疾病、心臟病和難以愈合的傷口類病變中具有多種治療用途[1-3]。此外，bFGF通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞的增殖在組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4-8]，它還在干細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)方面起到重要作用。然而，目前bFGF蛋白的生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低，阻礙了其在醫(yī)藥行業(yè)的商業(yè)應(yīng)用[9-10]。例如，在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下bFGF蛋白不穩(wěn)定，易降解，而例行更換含有商購bFGF的新鮮培養(yǎng)基會極大提高研發(fā)成本。為了促進(jìn)干細(xì)胞研究的發(fā)展，提高重組人bFGF的上游生產(chǎn)效益至關(guān)重要。

大腸桿菌(E.coli)作為細(xì)菌宿主，被廣泛用于表達(dá)無翻譯后修飾的重組蛋白。大腸桿菌具有生長速度快，成本低以及易于使用等優(yōu)點而被廣泛用于生物技術(shù)領(lǐng)域。然而，由于大腸桿菌是具有LPS外膜的革蘭氏陰性細(xì)菌，因此，純化的重組蛋白中一般伴有大量的內(nèi)毒素。當(dāng)將相關(guān)重組蛋白用于治療組織培養(yǎng)樣品或動物受試者時，這些內(nèi)毒素可能會導(dǎo)致不良的毒性作用。除非使用無內(nèi)毒素的水和內(nèi)毒素去除試劑盒，否則內(nèi)毒素很難通過下游純化工藝分離。由此相關(guān)試劑盒的使用提高了目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本。

相比之下，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，由于不含內(nèi)毒素，因此被FDA認(rèn)為是“公認(rèn)安全”(GRAS)的[11]。枯草芽孢桿菌能夠穩(wěn)定表達(dá)外源多肽，并且已被工程化以表達(dá)分泌的內(nèi)源蛋白和外源蛋白。然而，重組外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平比在大腸桿菌中低[12]，其原因主要有：1.枯草芽孢桿菌在其對數(shù)生長末期表達(dá)和分泌大量蛋白酶，對外源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)和產(chǎn)量產(chǎn)生不良影響；2.部分外源蛋白分泌到培養(yǎng)基中會影響宿主菌的生長，這同樣影響外源蛋白的高效表達(dá)；3.基因工程操作與大腸桿菌相比更為困難。這些因素?fù)?jù)認(rèn)為限制了枯草芽孢桿菌作為宿主細(xì)胞的使用。

內(nèi)含肽(intein)是從其宿主蛋白質(zhì)上自切除并催化側(cè)翼序列(外顯肽(extein))通過肽鍵連接的內(nèi)部蛋白質(zhì)元件。內(nèi)含肽切除不需要輔助酶或輔因子的翻譯后加工。該自切割過程稱為“蛋白質(zhì)剪接”。內(nèi)部蛋白質(zhì)序列的區(qū)段稱為“內(nèi)含肽”，外部蛋白質(zhì)序列的區(qū)段稱為“外顯肽”，其中上游外顯肽稱為“N-端外顯肽”并且下游外顯肽稱為“C-端外顯肽”。

蛋白質(zhì)內(nèi)含肽不僅豐富了遺傳信息翻譯后加工的內(nèi)容，而且在蛋白質(zhì)純化方面也獲得了廣泛的應(yīng)用。從內(nèi)含肽的內(nèi)部有無自導(dǎo)引歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，可將內(nèi)含肽分為2種類型。一種是全功能型內(nèi)含肽(maxi-intein)，其具有蛋白剪接活性和自導(dǎo)引核酸內(nèi)切酶(homing endonuclease)序列；另一種是微型內(nèi)含肽(mini-intein)，其僅具有蛋白剪接活性。根據(jù)其存在形式，分為整體內(nèi)含肽和分離內(nèi)含肽。前者的兩個剪接區(qū)域共同存在于同一多肽片段上。后者的兩個剪接區(qū)域存在于不同的多肽片段上，因此稱為分離內(nèi)含肽或斷裂內(nèi)含肽。整體內(nèi)含肽進(jìn)行順式剪接作用，而分離/斷裂內(nèi)含肽進(jìn)行反式剪接作用。