[發明專利]利用枯草芽孢桿菌和核酸內切酶制備人堿性成纖維細胞生長因子在審
| 申請號： | 202010164821.4 | 申請日： | 2020-03-11 |
| 公開（公告）號： | CN111235174A | 公開（公告）日： | 2020-06-05 |
| 發明（設計）人： | 鐘樹根;鄺緯陽 | 申請（專利權）人： | 夢芊科技知識產權有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/75 | 分類號： | C12N15/75;C12N1/21;C12P21/02;C07K1/22;C07K1/18;C12R1/125 |
| 代理公司： | 北京高文律師事務所 11359 | 代理人： | 王冬;韓威威 |
| 地址： | 中國香港葵涌油麻磡路*** | 國省代碼： | 香港;81 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 利用 枯草 芽孢 桿菌 核酸 內切酶 制備 堿性 纖維 細胞 生長因子 | ||
1.一種核酸構建體，其包含插入物，所述插入物從5’端到3’端包含編碼短肽親和標簽、來源于魚腥藻屬(Anabaena sp.)的反式剪接內含肽、以及外源多肽的多核甘酸序列，其中所述短肽親和標簽作為所述反式剪接內含肽的N-端外顯肽，并且所述外源多肽作為所述反式剪接內含肽的C-端外顯肽。
2.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述內含肽為魚腥藻屬DNA聚合酶III單元的內含肽(Asp DnaE)。
3.根據權利要求1或2所述的核酸構建體，其中所述內含肽包含與SEQ ID NO:2具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
4.根據權利要求1或2所述的核酸構建體，其中所述內含肽由SEQ ID NO:2所示的序列組成。
5.根據權利要求1-4任一項所述的核酸構建體，其中所述外源多肽是成纖維細胞生長因子(FGF)，例如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，尤其是人bFGF。
6.根據權利要求1-5任一項所述的核酸構建體，其中所述短肽親和標簽具有約4-15個氨基酸的長度，例如是5-15x His標簽，尤其是6x His標簽。
7.根據權利要求1-6任一項所述的核酸構建體，其進一步包含以下元件的一種或多種：啟動子、操縱子、增強子和核糖體結合位點。
8.根據權利要求1-7任一項所述的核酸構建體，從5’端到3’端，包含編碼乳糖操縱子-核糖體結合位點(RBS)-T7啟動子-6x His標簽-Asp DnaE內含肽-bFGF的核苷酸序列。
9.根據權利要求1-8任一項所述的核酸構建體，其進一步包含位于所述插入物上游的第一克隆位點和位于所述插入物下游的第二克隆位點，其中所述第一克隆位點和第二克隆位點允許所述核酸構建體插入表達載體。
10.一種表達載體，其包含權利要求1-9任一項所述的核酸構建體。
11.一種轉化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其包含權利要求10所述的表達載體。
12.一種產生外源多肽的方法，其包括在允許所述外源多肽表達的條件下培養權利要求11所述的轉化的枯草芽孢桿菌。
13.根據權利要求12所述的產生外源多肽的方法，其進一步包括分離經培養的所述枯草芽孢桿菌并使其裂解以獲得細胞裂解液，然后通過順序采用陽離子交換色譜法和肝素-瓊脂糖(HA)色譜從所述細胞裂解液純化所述外源多肽。
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