[發明專利]一種miRNA的檢測方法

在審

• 申請號: 202010164650.5
• 申請日: 2020-03-11
• 公開（公告）號: CN111321205A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 高婷婷;裴和中;張國亮;楊秀華
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 昆明人從眾知識產權代理有限公司 53204
• 代理人: 王娟

本發明公開一種miRNA的檢測方法，屬于化學和生物檢測技術領域。本發明所述方法為：肽核酸先與熒光染料標記的DNA（FAM?DNA）雜交形成雙鏈，當目標miRNA出現時，由于鏈置換反應將FAM?DNA置換下來，與PNA形成雙鏈結構，此過程熒光染料的熒光強度會發生變化，從而檢測出miRNA的含量。本發明所述方法具有快速、經濟、簡單方便的特點，不需借助大型儀器設備，也不需要精確的溫度控制和嚴格的洗滌步驟。該方法對目標miRNA的檢測限較低，可應用于腫瘤細胞裂解液中miRNA的檢測與腫瘤細胞總RNA提取后含量檢測，并且該檢測體系具有良好的特異性。

技術領域

本發明涉及一種miRNA的檢測方法，屬于化學和生物檢測技術領域。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一類內生的、長度約為20-24個核苷酸的小RNA，其在真核基因表達調控中有著廣泛的作用，miRNA不僅在基因位置上保守，序列上也呈現出高度的同源性，其調節著人類三分之一的基因，miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，它是腫瘤細胞主動分泌的，隨著腫瘤細胞的生成、凋零，miRNA的表達量一直在變化，所以每種miRNA的表達量代表了在某一刻人類體內健康或者疾病的信息，這使miRNA成為腫瘤標志物之一。因此對miRNA的檢測不僅使我們了解其在生命過程中的調節作用還可以實現對疾病的早期診斷。

miRNA傳統的檢測方法主要有逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、miRNA測序法、原位雜交法等，以上方法存在檢測耗時長，需要昂貴的檢測設備以及專業的檢測人員等缺點，因此開發快速，靈敏度高，特異性強，操作簡單方便的miRNA檢測方法具有重要意義，近年來，開發了許多新的miRNA分析方法，這些方法引入了分子信標，生物發光，酶分析，橋聯鏈式反應但依然存在特異性較低，檢測成本高、需要復雜的固定/分離步驟，限制了其應用。

肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）是一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物，通過計算機設計構建并最終人工合成的反義試劑，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩定的雙螺旋結構。由于PNA不帶負電荷，與DNA/RNA之間不存在靜電斥力，因而結合的穩定性和特異性都大為提高。miRNA在細胞內低表達，所以對其檢測的靈敏度具有更高的要求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種miRNA的檢測方法，本發明所述方法是基于目標miRNA引發鏈置換反應，阻斷CQDs-PNA/FAM-DNA之間的熒光能量共振轉移，實現miRNA含量的檢測，具體包括以下步驟：

（1）使肽核酸與碳量子點通過酰胺化學鍵共價偶聯，得到CQDs-PNA；采用FAM標記DNA，得到FAM-DNA。

（2）將CQDs-PNA和FAM-DNA加入到鹽溶液體系中進行雜交，雜交得到混合溶液I，I混合溶液中CQDs-PNA生物探針濃度為3~4μg/mL，FAM-DNA的濃度為180~200nmol/L。

（3）向所述混合溶液I中加入目標miRNA，室溫孵育20~30min，得到混合溶液II。

（4）采用已知濃度的待檢測目標miRNA為樣品，測定檢測體系的熒光強度，建立標準曲線，所述標準曲線為y=－0.062x+0.95。

（5）測量混合溶液II的熒光強度，并與建立的標準曲線進行比較，測定待檢測目標miRNA的濃度，當所測濃度為0時，代表不存在待檢測目標miRNA。

優選的，本發明所述鹽溶液體系為100mM Tris-HCl溶液體系，所述鹽溶液體系的pH為6.9~7.4。

優選的，本發明所述碳量子點尺寸為2~4 nm的球形顆粒在254 nm 紫外光照射下發藍光。