[發明專利]一種肝細胞癌血清中CTC的分離捕獲及檢測方法

在審

• 申請號: 202010163509.3
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111593024A
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 梁曉飛;易濱;武田;汪新燕;劉林春
• 申請（專利權）人: 梁曉飛;易濱
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

本發明涉及生物與醫學檢測技術領域，提供了一種肝細胞癌血清中CTC的分離捕獲方法，包括如下步驟：采集血樣并處理；洗滌結合了GPC3抗體的磁微粒；抗體孵育：將結合了GPC3抗體的磁微粒緩慢加入到處理好的血樣本中，調節搖床搖速，并將離心管傾斜固定于搖床上；分離捕獲CTC：將上述中的液體轉移至一支新的抗凝離心管中，靠于磁力架上，捕獲CTC的磁珠會吸附在磁力架一側，倒置磁力架和抗凝離心管，洗下離心管蓋上的樣本。本發明采用GPC3抗體結合免疫磁珠捕獲GPC3陽性的CTC，提高分選效率，結合獲悉釋放的DNA攜帶的遺傳信息的蛛絲馬跡并加以檢測分析，實現利用無創的液體活檢方式及時檢測DNA的分析方法。

技術領域

本發明涉及生物與醫學檢測技術領域，尤其涉及到一種肝細胞癌血清中CTC的分離捕獲及檢測方法。

背景技術

肝細胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是肝癌的主要組織學亞型，占原發性肝癌的90％，HCC的發病率約為每年10.1例/10萬人，每年因HCC而死亡的病例超過60萬例，是目前世界第六大惡性腫瘤，在腫瘤死因中排名第二，尤其是在亞洲、非洲和南部歐洲。流行病學統計調查顯示，在亞洲地區的HCC與乙肝病毒感染具有密切聯系。此外，丙肝病毒、肝硬化、過度酗酒以及黃曲霉素的攝入都是HCC的高危因素。HCC的發生是一個多階段、多因素的協同作用，經過啟動、促癌和演進等過程以及多個癌基因和相關基因參與的結果。由于HCC潛伏期長、增殖極為迅速，使得早期的診斷和治療受到了極大的限制。

近年來，隨著一些肝癌生物學標志物的發現，使得人類對肝癌發生、發展的認識有了長足的進步，磷脂酰基醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3)是Glypican家族的一員，屬膜性(membranous)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfateproteoglycan，HSPG)，在脊椎動物中有6個成員，基本結構相似，包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素(HS)鏈和糖基化磷脂酰基醇(GPI)。人類GPC3基因最早于1996年被克隆，與果蠅的Dally基因有同源性，由8個外顯子組成。在哺乳動物的胚胎期，GPC3通過影響多個分子信號通路而對組織器官的發育起重要調控作用，其功能缺失將導致多度生長和畸變綜合征(SGBS)。成人GPC3的異常表達與多種腫瘤的發生發展關系密切。在乳腺癌和卵巢癌中為表達缺失，在腎癌、肺鱗癌、甲狀腺癌、梅克爾細胞癌、胃癌、大腸癌等呈現過表達。有研究發現，用正常肝細胞進行體外實驗，發現GPC3蛋白和mRNA表達同時達到高峰時，細胞分裂增殖開始下降，揭示其負性調節肝細胞生長；在肝細胞癌早期，GPC3呈現高表達，并被學者研究證實GPC3具有對HCC進行早期檢測的價值。

本發明采用GPC3抗體結合免疫磁珠捕獲GPC3陽性的CTC，提高分選效率，結合DNA的分析方法，提高對HCC的檢測效果。

發明內容

本發明的目的是提供一種肝細胞癌血清中CTC的分離捕獲及檢測方法，采用GPC3抗體結合免疫磁珠捕獲GPC3陽性的CTC，提高分選效率，結合獲悉釋放的DNA攜帶的遺傳信息的蛛絲馬跡并加以檢測分析，實現利用無創的液體活檢方式及時檢測DNA的分析方法。

本發明采用的技術方案如下：一種肝細胞癌血清中CTC的分離捕獲方法，包括如下步驟：

(1)采集血樣：取來自肝細胞癌患者的外周血置于抗凝離心管中并混勻全血標本；

(2)對血樣進行前置處理：對步驟(1)中的血樣依次進行去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細胞、分層離心、去除白細胞的處理；

(3)洗滌磁微粒：吸取適量結合了GPC3抗體的磁微粒混懸液至EP管中，靜置后吸棄溶液，加入緩沖液混勻，靜置后棄上清，重復3次后用緩沖液重懸GPC3磁微粒至原體積；

(4)抗體孵育：將結合了GPC3抗體的磁微粒緩慢加入步驟(2)中處理好的血樣本中，調節搖床搖速，并將離心管傾斜固定于搖床上，室溫搖動30min，每10min混勻一次；