[發(fā)明專利]一種肝細(xì)胞癌血清中CTC的分離捕獲及檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010163509.3
• 申請(qǐng)日: 2020-03-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111593024A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁曉飛;易濱;武田;汪新燕;劉林春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 梁曉飛;易濱
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

1.一種肝細(xì)胞癌血清中CTC的分離捕獲方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)采集血樣：取來(lái)自肝細(xì)胞癌患者的外周血置于抗凝離心管中并混勻全血標(biāo)本；

(2)對(duì)血樣進(jìn)行前置處理：對(duì)步驟(1)中的血樣依次進(jìn)行去除血漿蛋白及血漿核酸、去除紅細(xì)胞、分層離心、去除白細(xì)胞的處理；

(3)洗滌磁微粒：吸取適量結(jié)合了GPC3抗體的磁微粒混懸液至EP管中，靜置后吸棄溶液，加入緩沖液混勻，靜置后棄上清，重復(fù)3次后用緩沖液重懸GPC3磁微粒至原體積；

(4)抗體孵育：將結(jié)合了GPC3抗體的磁微粒緩慢加入步驟(2)中處理好的血樣本中，調(diào)節(jié)搖床搖速，并將離心管傾斜固定于搖床上，室溫?fù)u動(dòng)30min，每10min混勻一次；

(5)分離捕獲CTC：將步驟(4)中的液體轉(zhuǎn)移至一支新的抗凝離心管中，靠于磁力架上，捕獲CTC的磁珠會(huì)吸附在磁力架一側(cè)，倒置磁力架和抗凝離心管，洗下離心管蓋上的樣本；

(6)靜置10分鐘后，吸棄澄清液，隨后加1mL dd H2O清洗磁球；

(7)加100uLCF1進(jìn)行涂片，在37℃條件下烘干；

(8)滴加4％多聚甲醛固定8min，在裝有2×SSC的37℃的水浴鍋中預(yù)熱10min；

(9)分別選用75％、85％和無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水，分別進(jìn)行2min，并在室溫下風(fēng)干；

(10)加10uL熒光探針并封片，置于雜交儀中76℃雜交10min，37℃雜交1.5h；

(11)用鑷子撕去封片膠，放入43℃的甲酰胺中，脫落蓋玻片，浸洗10min，再采用2×SSC浸洗15min，并每5min搖晃一次；

(12)在樣本區(qū)涂100uL的CK熒光抗體染色液，37℃濕盒避光條件下孵育1h；

(13)洗棄CK熒光抗體染色液，用0.2％BSA洗兩次后，加10uL DAPI蓋片讀片。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝細(xì)胞癌血清中CTC的分離捕獲方法，其特征在于：所述步驟(4)中，具體為取10uL結(jié)合了GPC3抗體的磁微粒至于7.5mL的樣品中混勻。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝細(xì)胞癌血清中CTC的分離捕獲方法，其特征在于：所述步驟(2)中血樣前置處理的具體步驟為：

S1：去除血漿蛋白及血漿核酸：將采集的血樣中加入緩沖液，離心去上清液，輕搖抗凝離心管混勻沉淀細(xì)胞；

S2：去除紅細(xì)胞：將上述混勻的抗凝離心管中加入裂解液，將抗凝離心管置于垂直混勻儀混勻，離心棄上清液，輕搖抗凝離心管混勻沉淀細(xì)胞后補(bǔ)加緩沖液；

S3：分層離心：于一支新的抗凝離心管中加入分層液，將S2中的所有液體疊加到分層液頂層，然后用緩沖液清洗S2中的抗凝離心管管壁，并將清洗液同時(shí)轉(zhuǎn)移至緩沖液頂層離心；

S4：去除白細(xì)胞：S3中的抗凝離心管離心后可見(jiàn)三層溶液，輕柔吸取最上兩層溶液于一支新的離心管內(nèi)，分別加緩沖液，顛倒混勻后離心棄上清液，加入緩沖液，混勻沉淀細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝細(xì)胞癌血清中CTC的分離捕獲方法，其特征在于：所述結(jié)合了GPC3抗體的磁微粒由氧化鐵Fe₃O₄納米顆粒、Cholesterol、GHDC、DOPC、GPC3組成。

5.一種肝細(xì)胞癌血清中CTC的檢測(cè)方法，其特征在于：采用QIAGEN試劑盒進(jìn)行基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的DNA提取的方法，具體步驟如下：

(a)取10ml步驟(2)中處理后的血樣并加入2.5倍體積的SolutionA，顛倒混勻，在8000rpm下離心5分鐘后棄掉上清液，并重復(fù)1-2次上述步驟；

(b)按照QIAGEN試劑盒附表提供的信息配制Solution B與Solution C的混合液；

(c)加入5ml Solution B與Solution C的混合液，用一次性塑料吸管吹打均勻，60℃的水浴或孵箱中孵育10分鐘，孵育期間顛倒混勻一次，溶液由紅色變?yōu)辄S綠色或棕色；

(d)加入等體積的異丙醇，充分顛倒混勻至出現(xiàn)絲狀或絮狀DNA；

(e)用移液器將絮狀物移到加有800μL、75％酒精的1.5ml EP管中，顛倒數(shù)次，然后在12000prm下離心1分鐘，棄掉上清液，室溫下干燥10～15分鐘；

(f)加入1000μL Elutionbuffer，60℃孵育10～15分鐘或過(guò)夜溶解DNA，用移液器或一次性塑料吸管吹打均勻，-20℃保存DNA；

(g)采用高通量測(cè)序法進(jìn)行膽道腫瘤血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞來(lái)源的DNA突變檢測(cè)。