[發(fā)明專利]實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)樹(shù)鼩SLC22A6基因轉(zhuǎn)錄水平方法及引物和試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010163309.8
• 申請(qǐng)日: 2020-03-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111154868A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王陳蕓;唐東紅;葉尤松;李哲麗;李濤;徐瑾;董鑫;張銘娟;黃明峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6883
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

本發(fā)明涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)樹(shù)鼩SLC22A6基因轉(zhuǎn)錄水平方法及引物和試劑盒，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法以樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，以SLC22A6 F和SLC22A6 R、GAPDH F和GAPDH R為特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)反應(yīng)體系中熒光的變化情況定量SLC22A6基因轉(zhuǎn)錄水平。本發(fā)明方法可對(duì)樹(shù)鼩SLC22A6基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況實(shí)施定量檢測(cè)，其操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，特異性強(qiáng)，靈敏度好，易于推廣應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)樹(shù)鼩SLC22A6基因轉(zhuǎn)錄水平方法及引物和試劑盒。

背景技術(shù)

11號(hào)染色體上SLC22A6基因編碼的OAT1蛋白屬于有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，SLC22A6在近曲腎小管上皮細(xì)胞的基側(cè)膜上表達(dá)。SLC22A6是主要轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)源性及外源性有機(jī)陰離子，尿酸的排泄是主要依靠腎小管中SLC22A6基因表達(dá)的OAT1完成的，OAT1是與尿酸分泌和排泄密切相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，OAT1和OAT3利用三級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，將尿酸鹽從管周隙轉(zhuǎn)運(yùn)到近端腎小管上皮細(xì)胞，也就是尿酸鹽分泌的第一步。SLC22A6基因表達(dá)降低，腎臟分泌減少有機(jī)陰離子積累，導(dǎo)致腎臟炎癥。

高尿酸血癥是由于尿酸鹽沉積或尿酸代謝障礙所致血清尿酸水平增高所引起的一種疾病，近年來(lái)發(fā)病率不斷上升。研究表明其不但是痛風(fēng)發(fā)作的病理基礎(chǔ)，還與糖尿病、高血壓、代謝紊亂綜合征、胰島素抵抗綜合癥等疾病有密切的關(guān)系，動(dòng)物模型作為研究疾病發(fā)病機(jī)制和藥理藥效的一種方法在科學(xué)發(fā)展中有著非常重要的作用。研究顯示血尿酸是腎功能異常的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其對(duì)腎功能的影響甚至超過(guò)尿蛋白量。隨著血尿酸的升高，發(fā)生腎衰竭的概率也會(huì)大幅增高。反之，腎臟是體內(nèi)調(diào)控尿酸排泄的重要器官，腎損傷會(huì)阻礙尿酸的排泄，使得血尿酸濃度進(jìn)一步升高，所以高尿酸血癥和腎功能損害是相互作用的，在臨床上表現(xiàn)為痛風(fēng)性腎病、急性高尿酸腎病、尿酸結(jié)石等。可見(jiàn)研究血尿酸升高導(dǎo)腎損傷的發(fā)病因素對(duì)于治療腎損傷疾病和高尿酸血癥都至關(guān)重要。同時(shí)探討高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)理和建立動(dòng)物模型對(duì)于攻克高尿酸血癥尤為重要。

文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)SLC22A6基因的研究主要集中在其蛋白的結(jié)構(gòu)、功能上，對(duì)SLC22A6基因轉(zhuǎn)錄水平的研究也及其重要，目前，采用基因編輯技術(shù)敲除SLC22A6基因的研究可以進(jìn)一步探索SLC22A6基因的作用機(jī)制，那么建立一種可靠的，高效的基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)方法就及其的迫切。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供種實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)樹(shù)鼩SLC22A6基因轉(zhuǎn)錄水平方法及引物和試劑盒。本發(fā)明挑選出靈敏度高，產(chǎn)物單一的引物，采用該引物進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用于樹(shù)鼩肝臟、腎臟、小腸上，都能高效的檢測(cè)SLC22A6基因，為研究SLC22A6基因和其表達(dá)產(chǎn)物OAT1的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

用于非診斷目的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)樹(shù)鼩SLC22A6基因轉(zhuǎn)錄水平方法，包括如下步驟：

步驟（1），分別以健康和待測(cè)樹(shù)鼩新鮮組織提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成得樹(shù)鼩腎臟組織cDNA第一鏈；所述的新鮮組織為新鮮腎臟、肝臟、小腸組織；