[發明專利]實時熒光定量PCR方法檢測樹鼩SLC22A6基因轉錄水平方法及引物和試劑盒

在審

• 申請號: 202010163309.8
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111154868A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 王陳蕓;唐東紅;葉尤松;李哲麗;李濤;徐瑾;董鑫;張銘娟;黃明峰
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

1.用于非診斷目的實時熒光定量PCR方法檢測樹鼩SLC22A6基因轉錄水平方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），分別以健康和待測樹鼩新鮮組織提取的總RNA為模板，逆轉錄合成得樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈；所述的新鮮組織為新鮮腎臟、肝臟、小腸組織；

步驟（2），建立樹鼩GAPDH基因及SLC22A6基因標準曲線：以Easy dilution梯度稀釋步驟（1）得到的健康樹鼩組織cDNA第一鏈，分別以未稀釋cDNA第一鏈及稀釋后的cDNA為模板，進行實時熒光定量檢測，并分別以SLC22A6 F和SLC22A6 R、GAPDH F和GAPDH R為特異性引物，進行實時熒光定量PCR擴增，分別得到健康樹鼩GAPDH基因、SLC22A6基因的溶解曲線和擴增曲線；

所述的SLC22A6 F、SLC22A6 R、GAPDH F、GAPDH R引物的序列如下：

SLC22A6 F：5＇-acagcagaagcagatggtcc-3＇；

SLC22A6 R：5＇-ggctctgtaaggccccattt-3＇；

GAPDH F：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；

GAPDH R：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇；

之后以起始模板量拷貝數Log₁₀的對數值為X軸，以Ct值為Y軸進行繪制，分別得到GAPDH基因、SLC22A6基因的標準曲線；

步驟（3），將步驟（1）得到的待測樹鼩組織cDNA第一鏈分別以SLC22A6 F和SLC22A6 R、GAPDH F和GAPDH R為特異性引物，進行實時熒光定量PCR擴增，擴增體系和擴增程序與步驟（2）相同，分別得到待測樹鼩GAPDH基因、SLC22A6基因的溶解曲線和擴增曲線；

之后根據步驟（2）得到的標準曲線進行計算，得到樹鼩SLC22A6基因轉錄水平。

2.根據權利要求1所述的用于非診斷目的實時熒光定量PCR方法檢測樹鼩SLC22A6基因轉錄水平方法，其特征在于，以Easy dilution梯度稀釋步驟（1）樹鼩組織cDNA第一鏈，梯度稀釋倍數分別為5倍、25倍、125倍、625倍。

3.根據權利要求1所述的用于非診斷目的實時熒光定量PCR方法檢測樹鼩SLC22A6基因轉錄水平方法，其特征在于：

實時熒光定量PCR擴增體系下：SYBR Premix Ex Taq II (2x) 5μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板0.8μL，去離子水3.4μL，總計10μL，上、下游引物濃度均為10μM；

實時熒光定量PCR擴增程序為：95℃預變性30s，95℃變性10s、60℃退火30s、40個循環。

4.檢測樹鼩SLC22A6基因轉錄水平的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括SLC22A6F、SLC22A6 R、GAPDH F和GAPDH R引物。

5.根據權利要求4所述的檢測樹鼩SLC22A6基因轉錄水平的引物的試劑盒，其特征在于，還包括SYBR Premix Ex Taq II (2x)。