[發明專利]一種磁微粒富集檢測生物醫學及環境標本新方法

在審

• 申請號: 202010162947.8
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111308066A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 張金菊
• 申請（專利權）人: 北京國科融智生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;C07K14/31;C12N15/70
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松;宋丹丹

1.一種磁微粒富集檢測生物醫學及環境標本新方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

制備免疫磁珠：使用偶聯方法將磁小體與SPA偶聯，制得免疫磁珠；

連接免疫磁珠和相應的抗體：將所述SPA的Bdomain與抗體非可變區FC端結合，制得結合抗體的免疫磁珠；

富集：將生物醫學及環境標本與連接相應的抗體的磁珠混合，富集與抗體對應的抗原。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述SPA為SPA重組蛋白，所述SPA重組蛋白的序列如下：

GGATCC CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKG

SGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAGCTT。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述SPA重組蛋白是在對來自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的SPA基因的結構進行改造的基礎上進行的，所述重組蛋白的合成方法包括以下步驟：

(a)在天然SPA基因的B domain的N端添加一個半胱氨酸引入巰基；

(b)在引入巰基的SPA基因的兩端分別添加BamHⅠ與HindⅢ酶切位點；

(c)將步驟(b)的SPA基因克隆進入PET28(a+)載體，并轉化進入E·coli BL21內；

(d)用IPTG進行誘導表達；

(e)用親和層析柱進行分離純化得到純凈蛋白，即得重組蛋白。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，制備所述免疫磁珠時使用的偶聯劑為3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠的構建方法是將磁小體膜的氨基與重組蛋白SPA中的巰基進行偶聯，所述構建方法包括以下步驟：

A.將3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯用DMSO溶解，3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯在DMSO中的濃度為5-15mg/mL，再加入PBS進行稀釋，3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯在DMSO和PBS總體積中的濃度為0.5-1.5mg/mL，制得SPDP溶液；

B.取磁小體與所述SPDP溶液混合后置于EP管中，所述磁小體在所述SPDP溶液中的濃度為0.5-1.5mg/mL，超聲波超聲30次，超聲1min，間歇1min；

C.用PBS(PH＝7.4)洗掉剩余的3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯，然后加入1mg/mL的重組蛋白0.8-1.5mL，按照步驟B中操作方法進行偶聯；

D.用PBS清洗偶聯后的磁小體5-10次，即得免疫磁珠。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，連接免疫磁珠和相應的抗體的方法包括以下步驟：

Ⅰ.取免疫磁珠加入抗體中使免疫磁珠在抗體中的濃度為0.5-1.5mg/mL，超聲波混勻，制得混合液；

Ⅱ.將所述混合液放置于搖床中在37℃、200rpm的條件下混合1.5-2.5h；

Ⅲ.將步驟B制得的混合物置于磁力架上磁力吸附0.5-1.5min,用PBS清洗5-10次，即得。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，富集的方法包括以下步驟：

S1:在待收集的樣本中加入免疫磁珠，制得免疫磁珠-樣本混合物；

S2:用超聲混合器將免疫磁珠-樣本混合物進行超聲，超聲時間不少于1min；

S3:再將免疫磁珠-樣本混合物置于37℃，200rpm條件下混合，混合時間不少于30min；

S4:用磁力架對免疫磁珠-樣本混合物進行磁力吸附后棄上清，用PBS(PH＝7.4)清洗三遍，即得磁珠-抗原混合物。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括檢測，所述檢測的方法是直接加入辣根過氧化物酶標記的二抗或堿性磷酸沒標記的二抗進行免疫檢測。